ヘッティンゲンミニピッグとランドレーツ豚における閉胸冠動脈閉塞/再灌流モデルにおける心筋梗塞後心不全

13健康で性的に成熟した女性ゲッティンゲンミニピッグ(年齢12〜14ヶ月)と10人の健康で性的に未熟な女性のランドラセ豚(年齢2〜3ヶ月)は、実験動物のケアと使用のための最新のガイドDHEWとEUガイドライン63/2010のサイズの推奨事項に準拠した豚の屋台に収容されました。動物は支払われなかった。動物室の温度は制御され、動物は12時間の明暗サイクルと害虫のないサイクルで飼われました。アドリビタム給餌は、ゲッティンゲンミニブタとランドレース豚の両方であからい体重増加につながるので、両方の品種の豚は制限された食事療法を与えられた。ゲッティンゲンミニピッグは、動物施設に到着すると早くから制限された食事をとり、研究期間全体を制限しました。特別ダイエットサービス豚チャウ180-220 g/食事/動物は、最初の2日間の「エルガードゲッティンゲンミニピッグの世話をする」ガイドライン(改訂日:2013年3月13日)に従って1日2回与えられました。3日目から12日目の間に、動物は50%の特別ダイエットサービス豚のチャウと50%のメンテナンスミニピッグダイエットを与えられました。14日目から研究動物の終わりまで、メンテナンスミニピッグダイエットを与えた。ランドレース豚は妊娠中の種まきチャウを受け取り、PIC Wean to Finish Manual 2008と2013によると、体重の1.5%が1日2回与えられました。すべての動物は個別に分配された食べ物を受け取り、チャウの競争を避けるために食物摂取量を監視した。摂食困難の動物は、傾向のある人員によって個別に援助されました。すべての動物は水道水アドリビタムを受け取りました。ゲッティンゲンミニブタとランドレースブタのポストMI HFの実験プロトコルを 図1に示す。 図 1.ランドレース豚とゲッティンゲンミニブタにおける心筋梗塞後誘発心不全の実験的プロトコル。 CMRI – 心臓磁気共鳴画像 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 1. ベースライン CMRI 麻酔開始の少なくとも12時間前に動物から食物を引き出すが、脱水を防ぐために水へのアクセスを確保する。 麻酔 ケタミン塩酸塩(12mg/kg)、キシラジン(1mg/kg)、およびアトロピン(0.04mg/kg)を頸部領域への筋肉内注射として動物の麻酔を誘発する。 体重と動物の長さを測定します。体表面積(BSA)の計算は、ゲッティンゲンミニピッグ(BSA [m 2]=(7.98×BW[kg] 2/3)/100)17とランドラレース豚のスウィンドルら(BSA [m2]= (7.3 ×4 BW[kg]0.66)のItokらによって記述された。 動物を挿管し、イオブルラン(2%イオブルラン、2 L/分酸素)で麻酔を維持する。気管内管の大きさは、各動物の個々の解剖学的特性に依存し、6.0〜7.5mmの範囲です。 18 G針で耳静脈をカニューレートし、リンゲル溶液(1 L/時間)で5%グルコースの投与を開始します。 CMRI 動物をCMRI施設に移し、0.4-0.5mg/kgのアトラキュリウム・ベシル酸i.v.を投与する。アトラキュリウムベシル酸は、CMRI測定中に呼吸物を避けるために使用される非脱分極、骨格筋弛緩剤である。正圧換気(16/分、350 mL容積、25-30 mmHg正圧)を開始します。 動物をスピーヌの位置に配置します。胸部に柔軟なコイルを配置し、32チャネルのコイルはCMRIのベッドに置かれる。1.5Tスキャナで非コントラスト心臓MRIを実行し、フェーズドアレイコイルとベクトル心電図(ECG)システムを使用して、心機能および形態(駆出率(EF)、心拍出量(CO)、チャンバーおよび壁寸法を評価する。1.2 ms エコー時間、40 ミリ秒の繰り返し時間、50 度フリップ角度、300 mm の視野、8 mm のスライス、および少なくとも 256×256 画像マトリックスを使用して、心の短軸および長軸ビューで、心の短軸および長軸ビューで、心電図ゲート、定常性プリレトロシネ MRI 技術を使用して、シネ MRI 画像を取得します。 左右の心室終末拡張期(LVEDVおよびRVEDV)およびエンドシストリックボリューム(LVESVおよびRVESV)、ストロークボリューム(LVSVおよびRVSV)、EF-s(LVEFおよびRVEF)および末側拡張期(LVED質量)およびエンドシストリック(RVED画像)の手動プラニメトリーによる質量を定量化する。2および4室のシネ画像をトレースすることによって、心房容積を定量化する。左心房容積をBSAに修正し、体表面積(LAVi)にインデックス付けされた心房容積を取得します。ローカライザー画像上の肺浮腫の存在を評価する。 心臓指数(CI)の計算にはBSAと心拍出量を使用してください。 イオブルランの離脱により麻酔を終了する。自発的な呼吸が戻ったら、動物を挿管し、i.v.カニューレを取り出し、ケージに戻します。 2. 前投薬、血管アクセスおよび冠動脈閉塞 前投薬 外科的処置の1日前に、500mgのアセチルサリチル酸と300mgのクロピドグレルを経口投与する。 鎮痛薬(メロキシカム0.4mg/kg体重)と抗生物質カクテル(ベンジルペニシリンプロカイン(24.8 mg/mL)、ベンジルペニシリン-ベンサチン(83.6) mg/mL)、ジヒドロストレプトミシン-硫酸塩(156.3 mg/mL)、3 mL/50 kg体重)は冠状動脈閉塞の日に筋肉内注射によって。 1.2.1~1.2.4のセクションで説明されている手順を繰り返します。 耳静脈カニューレを使用して、液の補充と薬物投与を行います。心室頻脈(VT)および心室細動(VF)を防ぐために、30分ごとに耳静脈を介して手順全体で1gの硫酸マグネシウムを投与する。 血管アクセス 動物を手術台の上に置き、手足を固定し、ウェッジを適用して動物をスピーヌ位置に固定します。 手術部位をポビドネヨウ素で消毒する。外科部位は、肉体とサルトリウス筋の間の皮膚折り畳みにあります。 カミソリで外科現場の毛を取り除きます。 アイントーヴェンの三角形に表面ECG電極を配置します。この三角形は、2つの前肢と左後肢によって形成され、電極は手足に配置されます。 正圧換気(16/分、350 mL容積、25-30 mmHg正圧)を開始します。 手術ドレープで、麻酔された外科領域を分離する。 K. S. Ettrup ら19.によって詳細に説明されているように大腿部に近づく .簡単に言えば、肉汁とサルトリウスの筋肉の間の皮膚に縦切開を行います。皮下組織と筋膜を分離します。大腿動脈を単離し、その下に2つの外科的縫合糸を置いて出血を制御する。 セルディンガー技術20,21を用いた6F-ACT導入機で大腿動脈を穿刺し、カニュールする。 シースを皮膚に固定します。 さらなる生化学的分析のために血液サンプリングのために動脈を使用してください。 十分な抗凝固を確保し、外科的介入の間に血栓症を防ぐために、大腿骨鞘を介して5000 IUヘパリンを投与する。手順を通して60分ごとに2500 IUヘパリンを読んでください。動物は介入全体の間におよそ370-440 IU/kgヘパリンを受けた。 大腿血管に圧力センサーを取り付け、外科的介入を通して動脈血圧を監視する。 圧力の較正のために各動物の心臓のレベルに圧力記録システムを置く。気泡を取り除いた後、3方向のストップコックが自由な空気の方向に開かれると、ゼロ圧力較正が行われる。 冠動脈閉塞、再灌流、および冠動脈内薬物投与この介入は、訓練を受けた介入心臓専門医によってのみ行われるべきであることに注意してください。大腿骨鞘を通して、ガイドワイヤーを大動脈弓に導入して進め、ガイドワイヤーの上に5F誘導カテーテルを導入する。まず、ガイドワイヤーを進めて大動脈根に近づく。血流の重大な閉塞を避けるために、薄い5F誘導カテーテルによる深い挿管を行う。 フッ素鏡を後部位置に配置します。 カテーテル内に血栓や気泡がないことを確認し、カテーテルに接続された注射器を用いて、カテーテルの少なくとも5 mLの吸引、カテーテルの体積を有することを確認します。 カテーテルの外側部分を、ラジオ造影剤(ヨビトリドール1.1 mL/50 kg体重)で満たされた注射器に接続します。 冠状動脈への気泡の注入を防ぐために、シリンジが上昇するように注意してください。 ベースライン血管造影を行うために、別々に挿管し、右冠動脈および左主冠動脈のオスティアを選択的に造影剤で満たす。技術的な詳細については、カテーテル法の教科書20,21を参照してください。 ベースライン血管造影後にBARI(血管形成術再血管形成調査のバイパス心筋危険指数)スコアを付ける。すべての末端動脈(左前頭下降、左サーカム、および右冠動脈の末端部分、ならびにラムス、対角線、鈍い辺縁、後方降下および後方枝)に対するスコアは、特定の基準22、23に基づいて割り当てられる。値 0 は、ほとんど重要でない船舶サイズを表します。対照的に、値3は、ベースと心臓の頂点の間の距離の3分の2の長さの大きな大きな動脈を定義します。右心室の限界と後下降性動脈中隔枝を考慮に入れないでください。 最終的なBARIスコア(左心室の割合)を、梗塞関連動脈の合計値を、LVを供給するすべての動脈の合計値(図2A-D)で割って計算し、BARIの評価で約25-30%のマイホカルジウムを達成するために、左前前側の下心動脈(LAD)冠動脈の閉塞部位を選択する。 経皮的な経年経冠動脈血管形成術(PTCA)ガイドワイヤーを導くカテーテルを通して挿入する。透視的ガイダンスの下で閉塞の計画部位に遠位に位置し、潜在的な合併症(例えば冠動脈解離、穿孔)の血管造影をチェックする。 冠状動脈径に基づいて最適なバルーンサイズを視覚的に推定して決定します。 PTCAガイドワイヤーの上にバルーンカテーテル(バルーン直径2.5mm、バルーン長12mm)を配置し、計画位置に進めます。 バルーンに造影剤を充填し、血管造影によってバルーンカテーテルの位置を確認します。 バルーンの公称圧力(7~9気圧)より下のバルーンを膨らませ、バルーン側面壁と容器の表面との間の柔らかい接触を開発します。ソフトタッチは、血管壁に損傷を与えることなく容器を閉塞させるのに十分なバルーン側壁の相互作用として定義されます。 コントラスト流れの停止を可視化して、血管造影で閉塞(TIMI 0)を確認します。ガイドワイヤーとバルーンを所定の位置に保ち、心臓虚血のびまん性を避けるために冠状動脈の大臭から導くカテーテルを引き戻します。 冠動脈内バルーンの脱臼を避けるために外科用ドレープにテープ器具。 ST標高による閉塞の ECG 記号を記録し、文書化します。 全体の手順の間に、注意深くバイタルサイン、心拍数(HR)、血圧、直腸プローブを使用してコア温度、およびパルスオキシメトリーを監視します。 コア温度を維持するために加熱装置で動物をカバーします。 脈のないVTまたはVFが発生した場合は静脈内ボーラスとして硫酸マグネシウム1gを投与し、すぐに100/分の頻度で胸部圧迫を開始する。静脈内ボーラスとして300J DCショックとリドカイン2-4 mg/kgを適用します。静脈内ボーラスとしてエピネフリンの1mgで収縮期を扱います. 冠状動脈閉塞の間、30分ごとに気球圧を点検してください。バルーン圧が 0.5 以上のバーの減少がある場合は、初期値に戻します。 冠動脈閉塞の終了直前に血管造影を行い、閉塞部位に遠位の気球配置とフローの欠如を確認します。 血栓症や不整脈を予防するために、2500 IUのヘパリンと1gの硫酸マグネシウムのコロナリカルを遅いボーラスとして投与する。 ゲッティンゲンミニブタで120分の心臓虚血の後、ランドレース豚で90分後にバルーンデフレで再灌流を開始します。 膨らんだバルーンを取り外します。 冠状血管造影による再灌流の成功を確認し、冠状血管の遠位部分(TIMI3)における血流を実証する。 3. 冠動脈内薬物投与 冠動脈塞栓を防ぐために、治療的灌流マイクロカテーテルを生理食前で満たす。 PTCAガイドワイヤーの上にマイクロカテーテルを置きます。 マイクロカテーテルの位置を予め確認します。マイクロカテーテルの先端は閉塞のレベルに置かれるべきである。 PTCA ガイドワイヤを取り外します。 マイクロカテーテルを灌流ポンプと接続し、再灌流開始から5分後に冠動脈内投与を開始する。 薬物投与後、マイクロカテーテルを除去する。 対照血管造影を行い、TIMI 3グレードのコントラストの流れをチェックし、その介入が空気塞栓または冠動脈解離につながったことを排除する。 4. 創傷閉鎖と術後ケア 動脈鞘を取り除き、大腿動脈近位を穿刺部位に縛り付ける。血管形成介入後の大腿動脈の閉塞は、毎日の獣医観察によって評価される豚の足の機能に影響を及ぼさない。 連続縫合糸を使用して創傷を閉じ、消毒コーティングを施します。 イオブルランの離脱により麻酔を終了する。 回復期間内の動物を注意深く監視し、手術後3日目まで12時間ごとに検査し、その後、研究が終了するまで24時間ごとに検査します。特に、飲食行動、無気力、感染の兆候、痛みを伴う状態、体重変化、移動性、および一般的な健康状態に注意する必要があります。処置の後、動物は術後初期の不必要なストレスを避けるためにケージ内の小群でバンと一緒に運ばれた。 5. ポストミCMRIとその評価 麻酔 セクション 1.2.1-1.2.4 で説明されている麻酔プロトコルを使用します。 CMRI 造影剤の静脈内ボーラスを投与します, 0.2 mmol /kg ガドブトロルの速度で 4 mL/秒, 手動インジェクターを使用して. 反転回復準備、グラデーションエコーシーケンスを使用して遅延強化画像を取ります。造影剤の投与後10〜15分後の短軸および長軸画像を得る。 評価 目が見えない方法でMASS 7.6解析ソフトウェアを使用して評価を行います。 短軸シネ画像で末拡張期の隔壁厚を評価します。 短軸遅延エンハンスメント画像で、傷跡のトランスムラリティを測定します。 遠隔の非梗塞心筋で得られた平均信号の上に5SDの信号強度の心筋を表すことによって遅れたコントラスト増強画像の手動の平面測定と心筋壊死を定量する。 6. 統計 連続データを標準誤差の平均±表示します。 反復測定一方のANOVAを使用して差を評価し、続いてゲッティンゲンミニブタでフィッシャーのLSDテストを行い、ランドレース豚でペアt検定を行います。BARIスコアは、2つの品種間のカイ二乗試験で、未対のt検定および死亡率と比較された。 データ評価にはグラフパッドプリズムを使用します。p<0.05の場合、この差は統計的に有意であると主張された。