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Biochimica

무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용하여 I3C로 단백질 결정의 파생

Published: January 16, 2021
doi:
10.3791/61894
, , ,
1School of Biological Sciences,The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences,The University of Adelaide

Summary

이 문서는 희소성 매트릭스 스크린에서 새로운 결정화 조건을 생성하기 위하여 마이크로 시드를 사용하여 I3C (5-아미노-2,4,6-트리오도이소프탈산)로 파생된 단백질 결정을 생성하는 방법을 제시합니다. 트레이는 액체 디스펜싱 로봇을 사용하거나 손으로 설정할 수 있습니다.

Abstract

X선 결정법을 이용한 단백질 구조 용해는 회절 상 문제의 고품질 디저프로이징 결정과 계산 용액을 모두 필요로 합니다. 적절한 상동성 모델이 없는 새로운 구조는 종종 실험상 정보를 제공하기 위해 무거운 원자로 파생됩니다. 제시된 프로토콜은 무작위 미세 종자 매트릭스 스크리닝과 유도성 단백질 결정의 생성을 중성 원자 분자 I3C(5-아미노-2,4,6-트리오도이소프탈산)와 결합하여 효율적으로 생성한다. I3C를 결정 격자에 통합함으로써, 회절 위상 문제는 단일 파장 비정상적인 분산(SAD) 페이싱을 사용하여 효율적으로 해결할 수 있다. I3C에서 요오드 원자의 등쪽 삼각형 배열은 올바른 비정상적인 하위 구조의 신속한 검증을 허용합니다. 이 프로토콜은 실험 적 제면에 관심이있는 결정학 기반 기술을 사용하여 거시 분자 구조를 해결하는 구조 생물학자에게 유용할 것입니다.

Introduction

구조 생물학 분야에서 X 선 결정학은 거대 분자의 원자 분해능 구조를 결정하는 금 표준 기술로 간주됩니다. 질병의 분자 기초를 이해하고, 합리적 약물 설계 프로젝트를 안내하고, 효소1,2의촉매 기전을 해명하기 위해 광범위하게 활용되고 있다. 구조적 데이터는 풍부한 지식을 제공하지만, 단백질 발현 및 정제, 결정화 및 구조 결정의 과정은 매우 힘들 수 있습니다. 이러한 프로젝트의 진행을 방해하는 여러 병목 현상이 일반적으로 발생하며 결정 구조 결정 파이프라인을 효율적으로 간소화하기 위해 이 문제를 해결해야 합니다.

재조합 발현 및 정제에 따라 결정화에 도움이되는 예비 조건을 식별해야하며 종종 X 선 결정학의 힘들고 시간이 많이 소요되는 측면을 식별해야합니다. 알려진 및 게시 된 조건을 통합하는 상용 희소 매트릭스 스크린이 병목 현상3,4를용이하게하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 고순수하고 집중된 단백질 샘플을 사용했음에도 불구하고 이러한 초기 화면에서 몇 가지 안타를 생성하는 것이 일반적입니다. 명확한 방울을 관찰하는 것은 단백질이 결정을 핵에 필요한 과포화 수준에 도달하지 못할 수 있음을 나타냅니다. 결정 핵 형성 및 성장을 장려하기 위해 기존 결정에서 생산된 씨앗을 조건에 첨가할 수 있으며 이를 통해 결정화 공간의 샘플링이 증가될 수 있습니다. 이레톤과 스토다드는 먼저 마이크로시드 매트릭스 스크리닝 방법5를도입하였다. 품질이 좋지 않은 결정은 종자 육수를 만들기 위해 분쇄된 다음 다른 염을 포함하는 결정화 조건에 체계적으로 추가하여 그렇지 않으면 형성되지 않았을 새로운 회절 품질의 결정을 생성했습니다. 이 기술은 D’Arcy 외.에 의해 더욱 개선되었으며, 무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝(rMMS)을 개발하여 종자를 예비 매트릭스 결정화 화면6,7로도입하였다. 이것은 결정의 질을 향상시키고 7의 요인에 의해 평균 결정화 안타의 수를 증가했습니다.

결정이 성공적으로 생성되고 X 선 회절 패턴을 얻은 후 ‘ 위상 문제’를 해결하는 형태로 또 다른 병목 현상이 발생합니다. 데이터 수집 과정에서 회절강도(진폭제제에 비례)가 기록되지만 위상 정보가 손실되어 즉각적인 구조 결정8을중단하는 위상 문제가 발생한다. 표적 단백질이 이전에 결정된 구조를 가진 단백질에 높은 서열 정체성을 공유하는 경우, 분자 대체는9,10,11,12의위상정보를추정하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 빠르고 저렴하지만 모델 구조를 사용할 수 없거나 적합하지 않을 수 있습니다. 상동성 모델 기반 분자 대체 방법의 성공은 서열 ID가 35%13이하로 떨어지면서 크게 떨어집니다. 적합한 상동성 모델이 없는 경우 ARCIMBOLDO14,15 및 AMPLE16과같은 ab initio 방법을 테스트할 수 있습니다. 이러한 메서드는 계산예측 모델 또는 단편을 분자 교체를 위한 시작점으로 사용합니다. 예측된 미끼 모델을 출발점으로 사용하는 AMPLE는 주로 β 시트를 함유한 대형(>100 잔류물) 단백질과 단백질의 구조를 해결하기 위해 고군분투합니다. 작은 조각을 더 큰 구조로 확장하기 위해 작은 조각을 맞추려는 ARCIMBOLDO는 고해상도 데이터(≤2 Å)와 알고리즘이 조각을 전체 구조로 확장하는 기능으로 제한됩니다.

분자 교체 방법이 실패하면 단일 파장(SAD19)또는 다중 파장(MAD20)에서동종 대체17,18 및 비정상적인 산란과 같은 직접적인 방법이 사용되어야 합니다. 이것은 종종 크리스탈이 형성되거나 무거운 원자로 파생되어야하는 진정한 새로운 구조의 경우입니다. 이는 무거운 원자 화합물, 화학적 변형(RNA내 5-브로무라실 편입) 또는 라벨이 부착된 단백질 발현(예: 셀레노메티오닌 또는 셀레노시스테인 아미노산을 1차 구조로 통합하는등)와함께 담그거나 공동 결정화함으로써 달성될 수 있다21,22. 이것은 결정화 과정을 더욱 복잡하게 하고 추가 검열 및 최적화를 요구합니다.

I3C(5-아미노-2,4,6-트리오도이소프탈산) 및 B3C(5아미노산-2,4,6-트리브로모이소프탈산)를 포함한 새로운 종류의 페이싱 화합물은 기존 페이싱 화합물23,24,25에비해 흥미로운 이점을 제공한다. I3C와 B3C 는 단백질과 구체적으로 상호 작용하고 결합 부위 특이성을 제공하는 직접 적인 페이징 방법 및 아미노 또는 카박스실레이트 기능성 그룹에 필요한 비정상적인 산란의 교대 배열을 가진 방향족 링 스캐폴드를 특징으로 합니다. 중금속 그룹의 후속 측퀴측 삼각형 배열은 페이징 하위 구조의 단순화된 검증을 가능하게 한다. 작성 시, 단백질 데이터 뱅크(PDB)에는 26개의 I3C 바운드 구조가 있으며, 그 중 20개는 SAD제면(26)을사용하여 해결되었다.

이 프로토콜은 중금속 유도 및 rMMS 스크리닝 방법을 결합하여 결정화 횟수를 동시에 늘리고 결정 유도 공정을 단순화함으로써 구조 결정 파이프라인의 효능을 향상시킨다. 우리는 이 방법이 암탉 달걀 흰자 리소지메와 박테리오파지 P68 27로부터의 새로운 리신 단백질의 영역으로 매우 효과적이었다는 것을입증하였다. 고도로 자동화된 자동 인력거 구조 결정 파이프라인을 사용하는 구조 솔루션은 I3C 제면 화합물에 맞게 특별히 조정된 것으로 설명되어 있습니다. AutoSol28,ELVES29 및 CRANK230과같은 다른 자동화 된 파이프 라인이 있습니다. SHELXC/D/E와 같은 완전 자동화되지 않은 패키지도31,32,33을사용할 수 있습니다. 이 방법은 PDB에 있는 동종 모형이 결여된 단백질을 공부하는 연구원에게 특히 유익합니다, 검열 및 최적화 단계의 수를 현저하게 감소시킴으로써. 이 방법을 위한 전제 조건은 단백질 결정 또는 표적 단백질의 결정 침전, 이전 결정화 예심에서 얻은.

Protocol

1. 실험 계획 및 고려 사항 관심 있는 단백질의 기존 결정을 사용하되, 바람직하게는 증기 확산 결정화를 통해 생성된다. 증기 확산 결정화의 일반화 프로토콜은 벤베누티와망가니(34)를참조하십시오. 오일 및 자유 인터페이스 확산 하에서 마이크로 배치와 같은 결정화의 다른 방법은 마이크로 시드를 생성하기 위해 분쇄하기 전에 결정을 수확해야합니다. 종자 재고를 준비하시면, 희생할 수 있는 최고 품질의 결정을 사용하십시오. 최고 품질의 결정은 형태에 기초하여 시각적으로 판단될 수 있거나, 이러한 데이터를 사용할 수 있는 경우 최상의 디퍼액이 선택될 수 있다. 시드를 통해 최적화된 후 더 나은 품질의 결정을 얻을 가능성이 높습니다. 결정이 없는 경우, 구엽염 및 바늘과 같은 결정침전을 사용할 수 있습니다. 소금 결정을 식별합니다. 소금 결정은 결정화 스크린에서 증가할 수 있고 단백질 결정 같이 보일 수 있습니다. rMMS에서 소금 결정을 사용하면 아무런 이점이 없으며 귀중한 샘플을 낭비하므로 소금 거짓 긍정을 제거하는 것이 중요합니다. 소금 결정이 분쇄될 때 큰 소리로 들립니다. 종자 주식을 생성하기 위해 크리스탈을 분쇄해야하므로이 전략은 특히 관련이 있습니다. 결정을 분쇄할 때 들리는 균열 소리가 들리면 크리스탈은 소금일 가능성이 높습니다. 단백질에 트립토판과 티로신 잔류물이 포함되어 있는 경우 자외선 형광 현미경 검사를 사용하여 이러한 조명 조건하에서 형광하는 단백질 결정을 식별하십시오. 이제트 염료(메틸렌 블루)를 사용하여 단백질 결정을 얼룩지게 하여 상대적으로 얼룩이 없는 소금 결정으로 분화하십시오. 그러나,이 절차는 더 파괴적이며 동일한 드롭의 복제에서 여분의 결정이있는 경우에만 권장됩니다.참고: 앞서 언급한 시험이 유망한 결과를 제공할 수 있지만, 소금 결정은 여전히 단백질 결정으로 오인될 수 있습니다. 이 경우 회절 실험을 사용하여 단백질과 소금 결정을 확실하게 분별할 수 있습니다. 2. 리튬 I3C 재고 준비 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에 I3C (5-아미노-2,4,6,6-트리오도이소프탈산)의 120 mg을 측정합니다. 2M 리튬 수산화의 200 μL에 I3C를 용해하십시오. 용액은 용해를 장려하기 위해 40-60 °C의 열 블록을 사용하여 부드럽게 가열 할 수 있습니다. 생성된 리튬 I3C 용액은 갈색이어야 하며 1M의 농도를 가지고 있습니다.주의: 수산화리튬은 부식성입니다. 안전 안경, 장갑 및 실험실 코트를 착용해야합니다. 솔루션의 pH를 측정합니다. 필요한 경우 소량의 염산 또는 2M 수산화리튬을 추가하여 pH를 7에서 8 사이로 조정합니다. 밀리큐 물을 추가하여 최종 용액을 400 μL로 만듭니다. I3C 재고 용액의 농도는 0.5M입니다.참고: 2.3 단계는 선택 사항입니다. 솔루션의 pH는 pH 조정 전에 pH 7-8 사이여야 합니다. 이 단계는 관심있는 단백질이 pH에 의해 강하게 영향을 받는 경우에 수행되어야 합니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 리튬 I3C는 적어도 2 주35동안 4 °C에서 어둠 속에서 보관 할 수 있습니다. 3. 단백질 육수에 I3C 추가 방법 1 표적 단백질의 150 μL 알리쿼트에 스톡 리튬 I3C를 추가합니다. 최종 농도는 5-40 mM 리튬 I3C 사이여야 합니다. 방법 2(부드러운 방법) 표적 단백질의 완충제와 일치하는 단백질 희석 완충제를 준비한다. 이 희석 버퍼에, 10-80 mMM 사이의 리튬 I3C의 농도를 제공하기 위해 주식 리튬 I3C를 추가합니다. 단백질 1:1을 단백질 희석 버퍼로 희석하여 5-40mMMM 사이의 리튬 I3C의 최종 농도를 제공합니다.참고: 일부 단백질은 방법 1에서 고농도의 리튬 I3C와 접촉하면 침전되며 다른 단백질은 이를 견딜 수 있습니다. 방법 2는 강수의 가능성을 감소시킵니다. 그러나, 이 방법은 단백질 농도를 반으로 줄입니다. 확립된 결정화 프로토콜이 없는 단백질의 경우, 10 mg/mL의 단백질 농도는 일반적으로 초기 결정화 스크리닝에 권장됩니다. I3C와 8의 단백질에 대한 초기 어금니 비율을 권장합니다. 단백질 농도 및 단백질에 대한 I3C의 어금니비는 초기 스크린 후에 최적화될 수 있다. 4. 종자 주식 만들기 크리스탈을 분쇄하기 위해 둥근 프로브를 만듭니다. 파란 불꽃에 분센 버너를 장착한 후 파스퇴르 파이펫을 가운데쪽으로 가열합니다. 트위저를 사용하여 파스퇴르 파이펫의 끝을 당겨 0.3mm 미만의 얇은 직경으로 그립니다. 중간 부분이 충분히 얇으면, 이 시점에서 파이펫을 분리하기 위해 화염에 그 세그먼트를 잡고 유리 프로브를 완료파이펫의 끝을 둥글게 합니다.참고: 둥근 프로브 크리스탈 분쇄기는 타사 공급업체에서 판매합니다. 이들은 둥근 프로브를 만들기위한 대안입니다. 얼음 위에 5 개의 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 가벼운 현미경하에서, 미세 결정을 생성하는 적당한 조건에 대한 결정화 트레이를 검사합니다. 이상적으로, 좋은 형태 큰 결정이 선택됩니다. 그러나,이 기술은 또한 가난한 형태 결정, 바늘, 플레이트, 미세 결정 및 구체염과 함께 작동합니다. 결정화 트레이를 잘 엽니다. 플라스틱으로 밀봉된 96개의 잘 결정화 트레이의 경우 메스를 사용하여 우물을 밀봉하는 플라스틱 밀봉을 잘라냅니다. 그리스로 밀봉 된 드롭 트레이를 걸 수 있습니다, 커버 슬립핀을 핀셋으로 제거하고 짝수 표면에 반전 할 수 있습니다. 70 μL의 저수지 용액을 미세원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위를 식힙니다. 다른 미세 원심 분리기 튜브에 90 μL의 저수지 용액을 추가하고 얼음으로 돌아가서 차가운 얼음으로 돌아갑니다.참고: 저수지에 충분한 부피가 없거나 존재하지 않는 경우(오일 아래 의 미세 배치의 경우), 적절한 시약을 혼합하여 결정화 저장소를 만듭니다. 크리스탈 프로브를 사용하여 낙하에 있는 결정을 교감하여 철저히 분쇄합니다. 결정은 현미경의 밑에 감시될 수 있는 완전히 분쇄될 필요가 있습니다. 낙하에서 모든 액체를 제거하고 저수지 용액으로 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 혼합 하 고 마이크로 원심 분리 기 튜브에서 혼합물의 2 μL을 가지고 우물에 다시 추가. 용액으로 우물을 헹구고 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮김하십시오. 이 헹도 단계를 다시 한 번 반복합니다. 이 시점부터, 혼합물의 마이크로 시드를 녹이지 않도록 마이크로 원심 분리기 튜브를 차갑게 유지하십시오. 튜브를 최대 속도로 최대 속도로 3분 동안 소용돌이치며, 과열을 방지하기 위해 얼음에서 튜브를 식히기 위해 정기적으로 멈춥니다.참고: 일부 미세 파종 프로토콜은 결정 분쇄7,36을돕기 위해 마이크로 센트심분리기 튜브에 폴리테트라플루오로틸렌 시드 구슬을 추가한다. 우리는 성공과 씨앗 비드의 사용없이 기술을 사용하지만, 크리스탈을 분쇄하기 위해 씨앗 비드를 활용하는 데 아무런 문제가 없습니다. 냉각된 저수지 용액 간에 10 μL을 순차적으로 전송하여 종자 재고의 10개의 직렬 희석 중 1을 만듭니다. -80°C에서 즉시 사용하지 않는 종자 주식을 저장합니다. 5. rMMS 화면 설정 액체 디스펜싱 로봇을 사용하여 96 개의 잘 선별 플레이트를 설정합니다. 로봇이 없는 경우 멀티채널 파이펫도 사용될 수 있다. 75 μL을 깊은 우물 블록에서 96 개의 잘 결정화 트레이로 옮기습니다. 결정화 강하에 1μL과 74 μL을 저장고에 추가합니다. 2단계에서 만든 리튬 I3C로 보충된 단백질 1 μL을 결정화 낙하로 옮기다. 종자 주식의 0.1 μL을 결정화 낙하로 옮기다. 투명 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하고 일정한 온도에서 플레이트를 배양하여 크리스탈 성장을 허용합니다. 매달려 있는 드롭 스크린 설정 매달려 있는 낙하 우물의 가장자리를 기름칠하십시오(매달려 있는 낙하 결정화 트레이는 24및 48웰 형식으로 찾을 수 있음). 500 μL 결정화 용액을 저수지로 옮기습니다. 유리 커버 슬라이드의 중앙 근처에 는 2단계에서 만든 리튬 I3C로 보충된 단백질 1 μL 방울을 놓습니다. 결정화 용액의 1 μL을 드롭에 추가합니다. 종자 주식의 0.1 μL을 결정화 낙하로 옮기다. 커버 슬라이드를 반전시키고 커버 슬라이드를 그리스로 밀어 결정화를 잘 밀봉합니다. 일정한 온도에서 플레이트를 배양하여 크리스탈 성장을 허용합니다.참고: 신규 및 테스트되지 않은 종자 주식으로 가장 농축된 종자 주식을 사용하여 결정화 안타를 얻을 확률을 극대화하는 것이 좋습니다. 후속 조건은 결정의 수를 최적화하기 위해 감소 된 종자 농도로 설정할 수 있습니다. 크리스탈 성장을 위해 현미경으로 크리스탈 트레이를 정기적으로 검사합니다. 결정이 충분한 품질인 경우 데이터 수집을 위해 수확할 수 있습니다. 크리스탈은 또한 새로운 종자 주식과 새로운 rMMS 스크린을 생성하여 반복적 최적화를 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 6. 데이터 수집 냉동 루프를 사용하여 크리스탈을 수확, 냉동은 결정을 보호하고 액체 질소에 그들을 냉각 플래시. 플래시 냉각 결정에 대한 자세한 내용은 Teng37 및 가만 및미첼(38)을참조하십시오. 극저온 보호 단계에서, 결정이 새로운 수성 용액을 통과하면, I3C는 극저온 보호 용액으로 거머리로 인해 결정에서 손실될 수 있다. 이를 완화하기 위해 결정화 조건과 일치하는 농도에서 극저온 보호 용액에 리튬 I3C를 사용합니다. 이 프로토콜을 사용하여 재배된 결정은 파라바 10312 오일 기반 냉동 보호제(햄프턴 리서치)를 사용하여 냉동 보호되었습니다.참고: 수정이 액체 질소에 저장되는 동안 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.주의: 액체 질소는 감기 화상을 일으킬 수 있습니다. 액체 질소는 밀폐된 공간에서 사용하는 경우 질식을 일으킬 수도 있습니다. X선 소스 곤니오미터에 크리스탈을 장착하고 X선 소스에 대한 프로토콜을 사용하여 회절 데이터를 수집합니다. 이 기술은 I3C의 요오드 원자에서 비정상적인 신호에 의존합니다. 따라서, 이 신호를 최대화하기 위하여 엑스레이의 에너지를 선택합니다. 가능한 한 낮은 튜닝 가능한 에너지와 싱크로트론 X 선 소스를 설정합니다. 많은 거시 분자 결정학 빔 라인의 경우 가장 낮은 구성 에너지는 8000 에서 8500 eV입니다. 양극 X선 소스를 회전하는 것은 조정할 수 없습니다. 구리를 이용한 일반적으로 사용되는 양극 소스는 8046 eV의 Kα 에지를 가지며, 이는 요오드(f”= 6.9 e)에 대해 좋은 비정상적인 신호를 제공한다. 크롬을 갖는 양극 소스는 5415 eV에서 Kα 에지를 가지며 요오드 (f”= 12.6 e)에 대한 큰 비정상적인 신호를 제공합니다. 방사선 손상은 비정상적인신호(39)를저하시킬 수 있으므로 데이터 수집 중에 중요한 문제입니다. 방사선 용량을 최소화하면서 최상의 회절을 달성하기 위해 빔의 노출 시간과 감쇠를 선택합니다.참고: 브롬 원자로 대체된 요오드 원자와 유사한 페이징 화합물에서, 방사선 손상은 탄소 브롬 결합의 무선 기분과 브롬 원자원자(24)의점유율 감소를 유발하는 것으로 나타났다. 역 빔 SAD 데이터 수집을 수집 전략으로 사용합니다. 데이터는 쐐기로 수집되며 반대 쪽 쐐기는 서로 수집됩니다. 이를 통해 프리델 쌍을 동등한 용량으로 수집할 수 있으므로 방사선 손상의 영향을 덜 받는 비정상적인 신호의 향상된 측정이 가능합니다. 예를 들어, 360°를 수집하는 8개의 쐐기 전략에는 쐐기 1(0°-45°), 웨지 2(180°-225°), 웨지 3(46°-90°), 웨지 4(225)의 순서로 데이터를 수집하는 것이 포함됩니다. °-270°), 웨지 5(90°-135°), 웨지 6(270°-315°), 웨지 7(135°-180°), 웨지 8(315°-360°).참고: 연속 회전은 역빔 데이터 수집에 대한 대체 수집 전략입니다. 최근 컬렉션 전략을 비교해 보려면 가르시 본테 & 카토나40을참조하십시오. 7. 데이터 처리 및 구조 솔루션 비정상적인 신호를 최대화하기 위해 XDS41을사용하여 회절 데이터에 대한 데이터 감소를 수행합니다. 데이터 감소 입력 매개 변수는 데이터 집합에 만전을 기하며 일부 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 다음은 시작하는 몇 가지 권장 사항입니다. 프리델의 법칙=FALSE를 설정합니다. STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE 및 STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE를 설정하여 수정을 두 번 실행합니다. 한 실행은 다른 실행보다 더 높은 비정상적인 신호를 가질 수 있습니다. 출력의 ‘아노말 코르’와 ‘시가노’ 분야를 사용하여 실행 사이의 비정상적인 신호를 비교합니다. 이를 통해 데이터 품질지표가 제공됩니다. XDS_ASCII SHELXC를 실행합니다. HKL 파일은 비정상적인 신호를 보다 정확하게 표시합니다. ‘Ranom’ 규율은 다른 해상도에서 비정상적인 신호를 표시합니다. POINTLESS42 및 AIMLESS43을 실행하여 데이터를 확장합니다. AIMLESS에서 매개 변수를 ANOMALOUS ON으로 설정합니다. GUI를 사용하는 경우 이상값 거부 및 병합 통계를 위해 비정상적인 쌍을 분리하는 옵션을 선택합니다. 비정상적인 신호를 최대화하려면 다양한 해상도 차단을 테스트해야 할 수 있습니다. 자동 인력거 자동 결정 구조 결정파이프라인(44)을사용하여 단백질 구조를 해결한다. 자동 인력거는 단계 문제를 해결하고 단백질 모델링 및 정제 소프트웨어를 사용하여 단백질의 결정 구조를 자동으로 구축하려고 시도할 것입니다. 상동성 모델 템플릿이없는 단백질의 경우 고급 모드에서 자동 인력거의 SAD 프로토콜을 실행합니다. 필요한 매개 변수를 입력합니다. 단백질을 분자 유형으로 선택합니다. 앙스트롬(Å)에서 데이터 수집 파장을 입력합니다. 요오드 원자가 사용되었음을 나타내기 위해 하위 구조 요소로 “I”를 선택합니다. I3C가 변조 분자였음을 나타내기 위해 하위 구조 유형으로 “i3c”를 선택합니다. 하위 구조 결정 방법으로 “sub_direct”을 선택합니다. 이 메서드는 SHELXD32를 사용하여 하위 구조를 검색합니다. 단량체당 예상 하위 구조수로 “3”을 선택합니다. 하위 구조 검색의 해상도 컷오프로 “1”을 입력합니다. 이를 통해 자동 인력거는 적절한 해상도 컷오프를 자동으로 결정할 수 있습니다. 단일 단량체, 데이터 집합의 우주 그룹 및 Matthews 계수를 기반으로 비대칭 단위의 분자 수에 잔류물의 수를 입력합니다. 필요에 맞는 적절한 보급 X선 데이터 보급 수준을 선택합니다. “AutoRickshaw 개발자”를 선택하면 문제가 발생할 경우 자동 인력거 개발자가 실행 문제를 해결할 수 있습니다. 비정상적인 데이터를 mtz 파일로 입력합니다. 단백질 서열을 seq, pir 또는 txt 파일로 입력합니다. seq 파일은 텍스트 편집기에서 생성할 수 있습니다(예: Windows에서 Notepad++9 또는 Linux의 나노). 새 파일을 만들고, 단백질의 1차 서열을 하나의 긴 줄로 입력하거나 라인 브레이크로 분리한다. .seq 파일 확장과 함께 파일을 저장합니다. 기관 이메일 주소를 입력합니다. 결과는 제공된 이메일 주소로 전송된 웹 링크를 통해 전달됩니다.참고 : AutoRickshaw는 X 선 결정 구조32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56, 57,58을해결하기 위해 다양한 결정예학적 소프트웨어 패키지를호출하는자동화 된 파이프 라인입니다. 자동 인력거 실행이 구조를 해결하지 못하면 다른 자동 인력거 설정을 테스트할 수 있습니다. 구조 결정 방법은 SHELXD 32 대신 페이서59를 사용하도록 “sub_phassade”로 변경할 수있습니다. 단량체당 예상되는 하위 구조의 수도 증가하거나 감소할 수 있습니다. 결정 구조의 실험 적 단계에서 자동 인력거는 단위 셀에 무거운 원자를 배치하여 하위 구조를 만듭니다. I3C의 요오드 원자의 등쪽 삼각형 배열은 하위 구조를 검증하는 효율적인 방법을 제시합니다. 6.3 단계가 실패하면 하위 구조를 검증하면 구조 해결 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자동 인력거 결과 페이지에서 무거운 원자 사이트 목록을 다운로드합니다. 그것은 “무거운 원자 사이트”라는 하이퍼 링크입니다. 이렇게 하면 무거운 원자 사이트가 있는 텍스트 파일이 다운로드됩니다. 파일의 파일 확장수를 .txt .pdb 변경합니다. Coot60에서PDB 파일을 엽니다. 대칭을 켜서 인접한 비대칭 단위의 다른 무거운 원자를 확인합니다. 비대칭 단위를 포함하여 무거운 원자 사이의 거리를 측정합니다. I3C는 6 앙스트롬의 측면 길이와 같은 삼각형으로 나타납니다. 이러한 치수가 있는 삼각형의 존재는 무거운 원자의 배치가 정확하다는 것을 나타냅니다.

Representative Results

I3C를 rMMS에 통합하면 생성된 결정 성장을 지원하는 새로운 조건을 생성할 수 있습니다.동시 rMMS 스크리닝 및 I3C 유도의 효능은 박테리오파지 P68로부터 의 두 가지 단백질, 암탉 알 백리수임(HEWL, lyophilized 분말로 수득)과 퍼티제 Orf11 라이신 N단말 도메인(Orf11 NTD)에서 입증되었다. 각 단백질은 4가지 조건하에서 PEG/ION HT에 대해 선별되었다: 시드, 시드, I3C로 시드를 받지 않고 I3C(그림1)로시드하였다. 두 단백질 모두, I3C의 단독 첨가는 결정화에 도움이 되는 조건의 수를 증가시키지 않았다. Orf11 NTD의 경우 I3C(도1B)의유무에 관계없이 하나의 적합한 조건만 확인되었다. I3C가 HEWL 스크린에 추가되었을 때, 적중 횟수가 31개에서 26개로 감소하여 단계적화합물(그림 1A)을도입할 때 결정화의 복잡성이 더해졌다. 다른 연구와 일치, RMMS 화면을 생성하는 상용 스파스 매트릭스 스크린에 씨앗을 추가 크게 두 단백질에 대한 가능한 결정화 조건의 수를 증가, HEWL 및 Orf11 NTD에 대한 2.1 및 6 배 증가의 결과, 각각6,61 (그림 1). 가장 중요한 것은, I3C와 시드의 동시 첨가는 시드되지 않은 스크린에 비해 안타수를 증가시켰으며, HEWL 및 Orf11 NTD에 대해 각각 2.3 및 7배 증가를 입증했다. I3C의 존재에서 rMMS에서 결정의 대부분은 우수한 결정 형태(도 2)를보여줍니다. Seeding을 통해 I3C rMMS 화면에서 수정 번호를 주의 깊게 제어할 수 있습니다.미세 종자 실험에서, 결정화 예심에 도입된 종자의 수는 종자 재고의 희석에 의해 제어될 수 있으며, 이는 드롭7,36에서핵의 정밀한 제어를 허용한다. 이것은 수시로 핵 형성 사이트에 단백질 분자의 감소된 경쟁이 있기 때문에 더 큰 결정이 형성하는 것을 허용합니다. 이러한 장점은 또한 I3C-rMMS 방법으로 확장되며 HEWL 및 Orf11 NTD 모두에서 성공적으로 입증되었습니다. 희석된 종자 스톡으로 I3C-rMMS 화면에서 확인된 결정화 상태의 레크리에이션은 더 적지만 더 큰결정(그림 3)을산출하였다. 슬픈 제면은 rMMS I3C 화면에서 파생된 결정으로부터 구조를 해결하는 데 사용할 수 있습니다.도 3에 도시된 희석종육을 이용하여 자란 결정은 단일 결정(도 4)으로부터회절 데이터를 이용하여 SAD제면체를 이용하여 단백질의 구조를 해결하는 데 사용되었다. 데이터는 호주 싱크로트론 MX1 빔 라인62에수집되었다. 자세한 데이터 수집 및 구조 솔루션 세부 정보는27에설명되어 있습니다. 도 1 – rMMS는 두 개의 테스트 단백질에 대한 I3C의 존재하에서 결정 성장을 위한 새로운 조건을 생성하는 데 사용되었다. 96개의 잘 증기 확산 결정화 스크린은 상용 희소매트릭스 스크린을 사용하여 수행되었다. (A)암탉 달걀 흰자 리소지메는 인덱스 HT 화면으로 테스트하였다. 트레이는 0.2M 암모늄 타테디베이직 pH 7.0, 20% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜 3350에서 자란 HEWL 결정으로 시드하였다. (B)박테리오파지 P68로부터의 Orf11 NTD는 PEG/ION 스크린으로 테스트하였다. Orf11 NTD 트레이는 파란색으로 표시된 시드되지 않은 화면에서 조건 G12에서 결정에서 시드되었습니다. 결정 성장을 지원하는 조건은 빨간색으로 표시됩니다. I3C의 존재와 부재에서 rMMS 시드 는 모두 시드 트레이보다 훨씬 더 많은 크리스탈 안타를 주었다. 트루옹 외27에서적응된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 2 – 도 1 (a) 및 (b)에 도시된 증기 확산 시험에서 자란 결정의 대표적인 이미지. 트루옹 외27에서적응된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3 – 종자 주식의 희석은 I3C-rMMS 방법을 사용하여 발견되는 결정화 조건에서 핵을 감소시키고 형성되는 결정수를 제어하는 효과적인 방법입니다. 드롭 내의 핵을 줄이면 종종 더 큰 치수로 커지는 결정이 발생합니다. 트루옹 외27에서적응된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 4 – Orf11 NTD(PDB ID 6O43) 및 HEWL(PDB ID 6PBB)은 I3C-rMMS 방법을 사용하여 결정화되고 자동 인력거 SAD 태싱을 사용하여 해결하였다. (A)HEWL 및 Orf11 NTD의 리본 구조는 실험적 태싱을 통해 해결되었습니다. (B)HeWL 및 Orf11 NTD에 결합된 I3C 분자. (C) I3C의 비정상적인 요오드 원자는 6Å의 등쪽 삼각형으로 배열된다. 따라서 이 삼각형의 존재는 그 위치에 I3C 분자가 있음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

분자 교체를 위한 적합한 상동성 모델이 없는 경우 새로운 단백질의 구조 적 결정은 실험적 해가 필요합니다. 이러한 방법은 무거운 원자를 단백질 결정 파이프라인에 복잡성을 더하고 해결해야 할 수많은 장애물을 도입할 수 있는 단백질 결정으로 통합해야 합니다. 무거운 원자는 셀레노메티오닌과 셀레노시스테인을 사용하여 라벨이 부착된 발현을 통해 단백질에 직접 통합될 수 있다. 이 방법은 비용이 많이 들고 힘들며 단백질 수율이 낮아질 수 있기 때문에, 표기 된 단백질은 결정화 조건이 발견되고 라벨이 없는 단백질로 최적화된 후에 종종 표현됩니다. 대안적으로, 결정은 무거운원자(22,63,64)를포함하는 용액에 담그면 도출될 수 있다. 이 방법은 종종 고품질의 결정을 사용하므로 강력한 결정화 방법이 이미 개발된 후에 수행됩니다. 이 방법을 사용하여 파생 된 결정을 성공적으로 얻으려면 침을 흡수 절차와 다른 태싱 화합물의 검사를 추가로 최적화해야하므로 이미 힘든 과정에 더 많은 시간을 추가해야합니다.

무거운 원자를 가진 단백질의 코결정화는 스크리닝 단계에서 수행될 수 있고, 따라서 프로세스를 효율적으로 간소화하고 손상을 일으킬 수 있는 결정 조작 단계를 감소시킨다. 그러나, 여전히 몇 가지 초기 결정화 안타와 호환 무거운 원자 화합물을 선택의 문제를 얻기의 잠재적인 시나리오가 존재. 현재 사용 가능한 많은 단계적 화합물은 결정화 조건에서 흔히 발견되는 침전제, 완충제 및 첨가제와 호환되지 않습니다. 그들은 황산염 및 인산염 완충제에서 불용성일 수 있고, 구산염과 아세테이트에 대한 탄레이트, HEPES 및 Tris 버퍼에 불리하게 반응하거나 DTT 및 β-mercaptoethanol21에의해 격리될 수 있다. I3C 페이징 화합물이러한 비호환성으로 고통 되지 않습니다.

본 연구에서는 I3C 태싱 화합물 및 rMMS의 동시 동시 결정화를 통해 SAD 단계에서 준비된 파생 결정을 생성하는 간소화된 방법이 제시된다. 두 기술의 조합은 결정화 안타의 수를 증가, 많은 조건은 개선 된 형태와 회절 특성을 갖는. Orf11 NTD 및 HEWL 테스트 사례 모두에서 I3C-rMMS 화면의 새로운 조건이 I3C가 존재하지 않을 때 결석한 것으로 확인되었습니다. 잠재적으로, I3C는 단백질에 호의적으로 결합하여 결정접점(27)의형성 및 안정화를 용이하게 할 수 있다. 차례로, 이것은 결정화를 유도하고 가능하게 회절 특성을 향상할 수 있습니다. 희소매트릭스 스크린과 호환되는 화합물 외에도 I3C는 본질적인 특성으로 인해 매력적인 페이싱 화합물이기도 합니다. 방향족 반지 스캐폴드에 요오드와 번갈아 기능 그룹은 단백질에 특정 결합을 허용합니다. 이로 인해 더 많은 점유가 발생하게 되고 배경신호(23)가잠재적으로 줄어듭니다. 더욱이, 상측 삼각형에서 비정상적인 산란기의 배열은 하위 구조에서 명백하며 I3C(도4B 및 4C)의결합을 신속하게 검증하는 데 사용될 수 있다. 마지막으로, 튜닝 가능한 싱크로트론 방사선뿐만 아니라 크롬 및 구리 회전 양극 X 선 소스와 비정상적인 신호를 생성 할 수 있습니다. 따라서 다양한 워크플로에 적용할 수 있습니다. I3C는 널리 사용할 수 있고 저렴 구입, 이 방법은 대부분의 구조 생물학 실험실에 대 한 도달 범위.

I3C-rMMS 메서드를 사용할 때 해결해야 할 몇 가지 실험적인 고려 사항이 있습니다. 이 방법은 단백질의 초기 결정성 물질을 얻을 수 없는 경우 적용될 수 없습니다. 어려운 경우에는 동종 단백질의 결정성 물질도 종자 육수를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. rMMS에 대한 이 교차 시드 접근 방식은 몇 가지 유망한 결과를 보여 주었다7. 종자 재고의 희석을 통해 결정 수를 최적화하는 것은 간과해서는 안되는 중요한 단계이며, 고품질의 큰 결정을 생산하고 적절한 회절 데이터를 획득할 가능성을 극대화합니다. 비대칭 단위에서 확인된 I3C 사이트가 거의 없는 경우 결정화에 도움이 되는 조건은 I3C의 농도증가로 더욱 최적화되어야 합니다. 이는 비정상적인 신호를 최대화하고 결정 유도를 돕기 위해 I3C의 점유율을 증가시킬 수 있다.

이 기술이 단백질 결정을 유도하는 최적의 방법이 아닐 수 있는 경우가 있을 수 있습니다. 단백질 또는 단백질 복합체의 크기가 증가함에 따라 단백질 표면에 제한된 수의 I3C 부위가 구조를 해결하기에 충분한 페스팅 파워를 제공하지 못할 수 있다. 단백질 크기가 페이싱을 방해하는 것으로 의심되는 이러한 시나리오에서, 단백질의 셀레노메티오닌 라벨링은 단백질을 페이징하는 데 더 실행 가능한 접근법일 수 있다. 단백질에 메티오닌 잔기의 적절한 수가 있는 경우(100잔물당적어도 하나의 메티오닌을 갖는 것이 권장됨) 및 고효율 셀레노메티오닌을 단백질으로 통합하는 것이 달성될 수 있다(예: 세균발현 시스템66),다중 높은 점유율 셀렌아움 아톰스(selenium atoms)가 결정상에 제시될 것이다.

또한 일부 단백질은 본질적으로 I3C로 의 도출에 적합하지 않을 수 있습니다. 단백질에 I3C 결합 사이트는 단백질 구조에 의존합니다. I3C 결합과 호환되는 노출 패치가 거의 없는 단백질이 자연적으로 존재할 수 있습니다. 따라서, I3C와 일부 표적 단백질을 조정하는 데 어려움이 있을 수 있다는 것은 예측할 수 없다.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 ANSTO의 일부인 호주 싱크로트론의 MX1 빔라인에서 수행되었습니다. 저자는 이 작품에 대한 논의를 위해 시어윈과 브루닝 연구소의 구성원을 인정하고 싶습니다. 저자는 또한 이 프로토콜을 개척한 오리지널 작품에 기여한 산토시 판지카르 박사와 린다 와이엇-시어윈 박사를 인정하고 싶습니다.

다음 기금은 인정된다: 호주 연구 위원회 (보조금 Nos. DP150103009 및 DP160101450에서 키스 E. 시어윈까지; 애들레이드 대학 (호주 정부 연구 교육 프로그램은 지아 Quyen 트루옹과 스테파니 응우옌에 장학금을 지급).

Materials

10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1
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Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).
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