Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi
Summary
Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.
Abstract
Drosophila melanogaster erkek embriyonik gonad, germ hücresi gelişimi, piRNA biyolojisi ve niş oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere gelişim biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için avantajlı bir modeldir. Burada, in vivo canlı görüntülemenin oldukça etkisiz olduğu bir dönemde gonad ex vivo’yu canlı olarak görüntülemek için bir diseksiyon tekniği sunuyoruz. Bu protokol, embriyoların bir görüntüleme kabına nasıl aktarılacağını, uygun şekilde evrelenmiş erkek embriyoların nasıl seçileceğini ve yapısal bütünlüğünü korurken gonadın çevresindeki dokudan nasıl diseke edileceğini özetlemektedir. Diseksiyonu takiben, gonadlar dinamik hücresel süreçleri görselleştirmek için konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Diseksiyon prosedürü kesin zamanlama ve el becerisi gerektirir, ancak yaygın hataların nasıl önleneceği ve bu zorlukların nasıl üstesinden gelineceği konusunda fikir veriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla bu, Drosophila embriyonik gonad için ilk diseksiyon protokolüdür ve aksi takdirde erişilemeyen bir zaman penceresinde canlı görüntülemeye izin verecektir. Bu teknik, doğal gonadal ortamlarında hücrelerin içinde veya arasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için farmakolojik veya hücre tipine özgü transgenik manipülasyonlarla birleştirilebilir.
Introduction
Drosophila melanogaster testis, birçok dinamik hücresel süreci anlamamız için bir paradigma olarak hizmet etmiştir. Bu modelin çalışmaları, kök hücre bölünme regülasyonu 1,2,3, germ hücresi gelişimi 4,5, piRNA biyolojisi 6,7,8 ve niş-kök hücre sinyal olayları9,10,11,12,13’e ışık tutmuştur. Bu model avantajlıdır çünkü genetik olarak izlenebilir 14,15’tir ve kök hücreleri doğal ortamlarında yaşayabileceğimiz birkaç yerden biridir 3,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin canlı görüntülemesi yetişkin doku ve erken embriyonik aşamalarla sınırlandırılmıştır, bu da geç embriyodaki gonadal dinamikler hakkındaki bilgimizde bir boşluk bırakarak, nişin ilk oluştuğu ve işlev görmeye başladığı kesin aşamadır.
Geç evre embriyonik gonad, anteriordaki somatik niş hücrelerden ve daha arka bölgeler boyunca somatik gonadal hücreler tarafından ensiklopedik germ hücrelerinden oluşan bir küredir19. Bu organ, erken embriyonik Aşama 17 17,20,21’e kadar in vivo olarak canlı olarak görüntülenebilir. Büyük ölçekli kas kasılmalarının başlaması nedeniyle daha fazla görüntüleme engellenir. Bu kasılmalar o kadar şiddetlidir ki, gonadı görüntüleme çerçevesinin dışına iter ve bu tür hareketler görüntüleme yazılımı ile düzeltilemez. Laboratuvarımız, canlı görüntüleme için bu zor dönemde meydana gelen niş oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmakla ilgilenmektedir. Bu nedenle, embriyonik Aşama 16’dan başlayarak gonadın canlı görüntüsüne ex vivo bir yaklaşım ürettik ve gonad gelişiminin bu önemli döneminde hücre dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırdık. Laboratuvarımızdan önceki çalışmalar, bu ex vivo görüntülemenin in vivo gonad gelişimi17’yi sadık bir şekilde özetlediğini göstermektedir. Bu teknik, Drosophila embriyonik gonadı için türünün ilk ve tek örneğidir.
Burada, geç embriyonik evrelerde gonadın ex vivo canlı görüntülenmesi için gerekli diseksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, farmakolojik tedavilerle veya gonad içindeki spesifik hücre soylarının transgenik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, kök hücre niş oluşumunun adımlarını başarıyla görüntüledik17. Bu görüntüleme yaklaşımı, kök hücre biyolojisi alanı için etkilidir, çünkü niş oluşumunun ilk aşamalarının doğal ortamında gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayacaktır15,17. Bu yöntem kök hücre biyolojisi alanı için faydalı olsa da, hücresel yeniden düzenlemeler 22,hücre yapışması 2,12,23 ve hücre göçü 23 dahil olmak üzere bu gelişimsel zaman noktasında gonadda meydana gelen dinamik süreçleri görselleştirmek için de uygulanabilir. Bu diseksiyon protokolü böylece birçok temel hücre biyolojik süreci hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gonadogenez sırasında, embriyonik gonad ve özellikle erkek gonad15 içindeki kök hücre nişi hızlı morfolojik değişikliklere uğrar. Bu dinamik değişikliklerin altında yatan gelişimsel mekanizmalar en iyi canlı görüntüleme teknikleriyle anlaşılır. Bununla birlikte, embriyonik Aşama 17’de, gonadın in vivo görüntülenmesi, büyük ölçekli kas kasılmalarının başlamasıyla imkansız hale getirilir17. Bu protokolle başarılı bir alternati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lindsey W. Plasschaert ve Justin Sui’ye bu protokolün erken gelişimine yaptıkları önemli katkılar için teşekkür ederiz. Yazarlar, sinek topluluğuna reaktiflerle cömertlikleri için ve özellikle Ruth Lehmann ve Benjamin Lin’e, yayınlanmadan önce no.5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ hattını hediye ettikleri için minnettardır. Bu çalışmada Bloomington Drosophila Stok Merkezi’nden (NIH P40OD018537) elde edilen stoklar kullanılmıştır. Bu çalışma NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ve R35GM136270 (S.D) ve eğitim hibeleri T32GM007229 (B.W.) ve F32GM125123 (L.A.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
Riferimenti
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Biologia dello sviluppo. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Biologia dello sviluppo. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer’s solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
