Experimentelle autoimmune Uveitis: Ein intraokulares entzündliches Mausmodell
Summary
In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll vor, das es dem Prüfarzt ermöglicht, ein Mausmodell der intraokularen Uveitis zu erstellen. Dieses etablierte Modell, das gemeinhin als experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bezeichnet wird, erfasst viele Aspekte menschlicher Erkrankungen. Im Folgenden beschreiben wir, wie das Fortschreiten der Krankheit mit mehreren Ablesungen induziert und überwacht werden kann.
Abstract
Die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) wird von Immunzellen angetrieben, die auf Selbstantigene reagieren. Viele Merkmale dieses nicht-infektiösen, intraokularen Entzündungskrankheitsmodells rekapitulieren den klinischen Phänotyp der posterioren Uveitis, die den Menschen betrifft. EAU wurde zuverlässig eingesetzt, um die Wirksamkeit neuartiger Entzündungstherapeutika und ihre Wirkungsweise zu untersuchen und die Mechanismen weiter zu untersuchen, die das Fortschreiten der Erkrankung bei intraokularen Erkrankungen unterstützen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur EAU-Induktion in der C57BL/6J-Maus zur Verfügung – dem am weitesten verbreiteten Modellorganismus mit Anfälligkeit für diese Krankheit. Die klinische Beurteilung des Schweregrads und des Fortschreitens der Erkrankung wird mittels Fundoskopie, histologischer Untersuchung und Fluoreszenzangiographie nachgewiesen. Das Induktionsverfahren beinhaltet die subkutane Injektion einer Emulsion, die ein Peptid (IRBP1-20) aus dem okulären Protein Interphotorezeptor-Retinoid-bindendes Protein (auch bekannt als Retinol-bindendes Protein 3), Complete Freund’s Adjuvans (CFA) enthält und mit abgetötetem Mycobacterium tuberculosis ergänzt wird. Auf die Injektion dieser viskosen Emulsion in den Nacken folgt eine einmalige intraperitoneale Injektion von Bordetella pertussis-Toxin . Zu Beginn der Symptome (Tag 12-14) und unter Vollnarkose werden fundoskopische Bilder gemacht, um das Fortschreiten der Krankheit durch klinische Untersuchung zu beurteilen. Diese Daten können direkt mit denen zu späteren Zeitpunkten und dem Höhepunkt der Erkrankung (Tag 20-22) verglichen werden, wobei Unterschiede analysiert werden. Gleichzeitig ermöglicht dieses Protokoll dem Forscher, mögliche Unterschiede in der Gefäßpermeabilität und -schädigung mittels Fluoreszenzangiographie zu beurteilen. EAU kann in anderen Mausstämmen – sowohl Wildtyp- als auch in gentechnisch veränderten – induziert und mit neuartigen Therapien kombiniert werden, die Flexibilität für die Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten und/oder Krankheitsmechanismen bieten.
Introduction
Dieses Protokoll wird zeigen, wie die experimentelle Autoimmun-Uveitis (EAU) bei der C57BL/6J-Maus durch eine einzige subkutane Injektion eines retinalen Antigens in ein emulgiertes Adjuvans induziert werden kann. Methoden zur Überwachung und Beurteilung des Krankheitsverlaufs werden durch fundoskopische Bildgebung und histologische Untersuchung detailliert beschrieben, wobei die Messparameter darin beschrieben sind. Darüber hinaus wird die Fluoreszenzangiographie, eine Technik zur Untersuchung der Struktur und Permeabilität der retinalen Blutgefäße, diskutiert.
Dieses EAU-Modell rekapituliert zentrale Merkmale der nicht-infektiösen posterioren Uveitis beim Menschen in Bezug auf die klinisch-pathologischen Merkmale und die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen, die die Krankheit antreiben. EAU wird durch Th1- und/oder Th17-Untergruppen von selbstreaktiven CD4+T-Lymphozyten vermittelt, wie in adoptiven Transferexperimenten und bei IFNγ-depletierten Mäusengezeigt wurde 1. Ein Großteil unseres Verständnisses der möglichen Rolle dieser Zellen bei Uveitis stammt aus der Untersuchung von EAU2, bei der sowohl Th1- als auch Th17-Zellen in den Netzhautgeweben nachgewiesen werden3. Häufig wird EAU als präklinisches Modell verwendet, um den Nutzen neuartiger Therapien bei der Abschwächung von Krankheiten zu bewerten. Therapeutische Ansätze, die die EAU-Krankheit erfolgreich moduliert haben, haben in der Klinik eine gewisse Wirksamkeit gezeigt und den von der FDA zugelassenen Status erreicht. Beispiele hierfür sind Gruppen von immunregulatorischen Medikamenten wie die T-Zell-Targeting-Therapien: Ciclosporin, FK-506 und Rapamycin 4,5,6. In jüngster Zeit wurden in diesem Modell auch Interventionen untersucht, die auf neuartige Signalwege abzielen, um sowohl den Mechanismus als auch die Wirkung auf den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Dazu gehört die gezielte Transkriptionsregulation durch Chromatin-Reader, Bromodomain Extra-Terminal (BET)-Proteine und P-TEFb-Inhibitoren3. Darüber hinaus haben konventionellere Ansätze wie ein VLA-4-Inhibitor kürzlich eine Unterdrückung der EAU durch Modulation von Effektor-CD4+ T-Zellen gezeigt7. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das Targeting von Th17-Zellen mit TMP778, einem inversen RORγt-Agonisten, auch EAU8 signifikant unterdrückt. Darüber hinaus bietet dieses Modell die Möglichkeit, chronische Autoimmunentzündungen in der Netzhaut und die damit verbundenen zugrunde liegenden Mechanismen wie das Lymphozyten-Priming zu untersuchen.
Die primären Messwerte für präklinische EAU-Studien sind die klinische Beurteilung durch die Durchführung einer retinalen Fundoskopie und seltener durch die Beurteilung der Netzhautintegrität durch optische Kohärenztomographie (OCT). Die histopathologische Beurteilung der Netzhaut und die Immunphänotypisierung der Netzhautzellen durch Durchflusszytometrie erfolgen dann am Ende der Sitzung. Die Fundoskopie ist ein einfach zu bedienendes Live-Bildgebungssystem, das eine schnelle und reproduzierbare klinische Beurteilung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Für immunhistochemische Untersuchungen basieren die Techniken auf der Präparation von Netzhautschnitten, die es uns ermöglichen, die Gewebearchitektur auf den Grad der Entzündung und der strukturellen Schädigung zu untersuchen9. Die Bewertungskriterien und die herkömmlichen Bewertungssysteme für alle verwendeten Techniken werden in diesem Protokoll beschrieben. Das Ausmaß der Schädigung, die mittels fundoskopischer Bildgebung erfasst wird, korreliert oft eng mit histologischen Veränderungen. Dieser duale Ansatz zur Überwachung und Bewertung des Schweregrads der Erkrankung bietet eine höhere Sensitivität und zuverlässigere Messergebnisse.
EAU ist ein etabliertes, häufig verwendetes Modell für die präklinische Prüfung und Untersuchung von immunvermittelten Augenerkrankungen. Dieses Modell ist zuverlässig und reproduzierbar mit einer Inzidenz von >95% und generiert umfassende Daten, die verwendet werden können, um neue Therapien zur Behandlung von intraokularen entzündlichen Erkrankungen, die weltweit eine der Hauptursachen für Blindheit im erwerbsfähigen Alter darstellen, zu validieren oder abzulehnen10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentelle Tiermodelle sind notwendige Werkzeuge für die Untersuchung der Krankheitspathogenese und die präklinische Erprobung neuer therapeutischer Paradigmen. Im aktuellen Protokoll haben wir eine Methodik zur Induktion, Überwachung und Bewertung der EAU, eines experimentellen Modells der intraokularen inflammatorischen Uveitis, diskutiert. Dieses EAU-Modell hat eine Inzidenz von mehr als 95%, wenn alle Verfahren gemäß dem hier beschriebenen Protokoll durchgeführt werden, und führt zur Entwicklung einer chro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG erhielt eine UCL Impact Studentship und Rosetrees Trust-Finanzierung, um CB zu unterstützen. VC erhielt einen Forschungskooperationszuschuss von Akari Therapeutics Inc. Wir danken dem UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit, insbesondere Frau Alison O’Hara und ihrem Team für ihre technische Unterstützung.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
Riferimenti
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
