JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Изучение TGF-β сигнализации и TGF-β индуцированных Эпителиальный к мезенхимальный переход в рак молочной железы и нормальных клеток

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61830
, , , ,
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology,Leiden University Medical Center

Summary

Мы описываем систематический рабочий процесс для исследования TGF-β сигнализации и TGF-β индуцированной ЭМТ, изучая белок и экспрессию генов, участвующих в этом сигнальном пути. Методы включают западные blotting, анализ репортера luciferase, qPCR, и окрашивание immunofluorescence.

Abstract

Преобразование фактора роста β (TGF-β) является секретным многофункциональным фактором, который играет ключевую роль в межклеточной коммуникации. Возмущение TGF-β может привести к раку молочной железы. TGF-β вызывает свое влияние на пролиферацию и дифференциацию с помощью специфических клеточных поверхностей TGF-β типа I и рецепторов типа II (т.е. ТРИ и ТЕРИИ), которые содержат внутренний домен серина/трионина киназы. При формировании гетеромерного комплекса, β TGF-β, активированный ТЦРИ вызывает внутриклеточную сигнализацию путем фосфорилирования SMAD2 и SMAD3. Эти активированные SMAD образуют гетеромерные комплексы с SMAD4 для регулирования конкретных генов-мишеней, включая ингибитор активации плазминогена 1 (PAI-1, кодируемый геном SERPINE1). Индукция эпителиального к мезенхимального перехода (ЭМТ) позволяет эпителиальным раковым клеткам на первичном участке или во время колонизации в отдаленных местах получить инвазивный фенотип и стимулировать прогрессирование опухоли. TGF-β выступает в качестве мощного индуктора вторжения рака молочной железы, вождение скорой помощью. Здесь мы описываем систематические методы исследования сигнальных и эмТ-ответов TGF-β с использованием предмальнагиальных клеток MCF10A-RAS (M2) и клеток эпителии мыши NMuMG. Мы описываем методы определения TGF-β-индуцированного фосфорилирования SMAD2 западными blotting, SMAD3/SMAD4-зависимой транскрипционной активностью с использованием активности репортера люциферазы и экспрессии целевого гена SERPINE1 количественной цепной реакцией в реальном времени(qRT-PCR). Кроме того, описаны методы изучения ЭМТ, вызванной TGF-β путем измерения изменений в морфологии, эпителиальной и мезенхимальной экспрессии маркеров, окрашивания филаментного актина и окрашивания иммунофлюоресценции Е-кадерин. Два селективных малых молекул TGF-β рецепторов киназы ингибиторы, GW788388 и SB431542, были использованы для блокирования TGF-β-индуцированной SMAD2 фосфорилирования, целевых генов и изменения в экспрессии маркера EMT. Кроме того, мы описываем трансдифференцирование мезенхимальной груди Py2T мурин эпителиальных опухолевых клеток в адипоциты. Методы изучения TGF-β сигнализации и ЭМТ при раке молочной железы могут способствовать новым терапевтическим подходам к раку молочной железы.

Introduction

Цитокины, трансформующие фактор роста-β (TGF-β), являются прототипом большой группы структурно и функционально связанных регуляторных полипептидов, включая TGF-к (т.е. TGF-1, -No2 и -No3), костные морфогенные белки (БМП) иактивины 1,2. Все эти цитокины играют важную роль в эмбриональном развитии и в поддержании тканей и гомеостазаорганов 3. Неправильное регулирование TGF-β может привести к большому разнообразию заболеваний, в том числерак 4,5. TGF-β играет сложную, двойную роль в прогрессировании рака: в нормальных и предмальтеняющих эпителиальных клетках, TGF-β ведет себя как опухолевый супрессор, подавляя пролиферацию и вызываяапоптоз 6,7; однако, на поздней стадии прогрессирования опухоли, когда цитостатические реакции блокируются активацией онкогенов или потерей генов супрессора опухоли, TGF-β действует как усилитель опухоли, способствуя эпителиалю к мезенхимальной переходу (EMT) в раковых клетках, тем самым позволяя вторжениюраковыхклеток и метастазам, действуя на клетки в микроэнвиронеопухоли, и стимулируя ангиогенез ииммунный

TGF-β выделяется как неактивная молекула-предшественник, содержащая зрелый карбокси-терминал TGF-β и связанный с задержкой пептид (LAP)11. Этот небольшой комплекс может быть ковалентно связан скрытым TGF-β связывающим белком (LTBP)12. Освобождение зрелых TGF-β может быть опосредовано действием конкретных протеаз, которые расщепляют LAP или механическим потянув LAP в интегрин-зависимыйпроцесс 13,14. В дополнение к LTBP, гликопротеин повторения преобладают (GARP) высоко выражается на поверхности регуляторных Т-клеток (Tregs) и играет аналогичную роль, как LTBP в регулировании активации TGF-β15,16. GARP напрямую связывается с скрытыми TGF-β путем дисульфидной связи и нековалентной ассоциации. Активация TGF-β из комплекса GARP/TGF-β требует integrins17. Зрелые рецепторы TGF-β связываются с рецепторами TGF-β serine/threonine kinase,т.е. рецепторами TGF-β типа I (T’RI) и TGF-β типа II (ТИРИИ) для инициирования сигнализации. Привязка ТГФ-β к ТРИИ способствует набору ТРИ и формированию гетеромерного комплекса. Впоследствии ТЗРИ фосфорилируется киназой T’RII на остатках серина и трионина в коротком мотиве, богатом глицином и серином (GS), что приводит к егоактивации 19,20. После активации активированный ТЗРИ набирает и фосфорилатирует свои субстраты: два специфических рецептора SMAD (R-SMADs), которые включают SMAD2 и SMAD3 (Рисунок 1). R-SMAD имеют аналогичную общую структуру с двумя так называемыми доменами Mad гомологии, MH1 и MH2, которые разделены пролин-богатым регионом связующим звеном(рисунок 2). Мотив связывания ДНК в домене MH1 SMAD3 не сохраняется между SMAD2 и SMAD3, и SMAD2 не может напрямую связать ДНК из-за двух вставок в домен MH1 (exon 3 и L1). SMAD2 и SMAD3 могут быть активированы фосфорилированием мотива SSXS в их C-термини(рисунок 2). Фосфорилированный SMAD2/3 образует гетеромерные комплексы с общим посредником SMAD, SMAD4, который транслокирует в ядро, чтобы модулировать транскрипциюгенов-мишеней (рисунок 1)7,21. Этот канонический сигнальный путь SMAD точно регулируется и генерирует конкретные клеточные и тканевые реакции, такие как регуляции клеточной судьбы и метастазы опухолевых клеток ивторжение 22. В дополнение к TGF-β-SMAD сигнализации, не-SMAD сигнальные пути также могут быть непосредственно активированы рецепторами для регулирования вниз по течению клеточныхреакций 23.

Во время прогрессирования опухоли, активация TGF-β индуцированных SMAD-зависимых и SMAD-независимых путей необходимы для индукции ЭМТ. ЭМТ является обратимым процессом, в котором опухолевые клетки отразятся от эпителиального фенотипа, который связан с потерей контактов клеток и снижением апокалико-базальной полярности, до мезенхимального фенотипа с повышенной подвижностью и способностьювторжения 24. ЭМТ характеризуется повышенным экспрессией мезенхимальных белков маркера, включая N-кадерин, виментин, зеб2 и улитку1/2, и сопутствуя даунрегуляции эпителиальных маркеров, таких как E-кадерин и β-катенин(рисунок 3)25. Однако переход от эпителиального к мезенхимальной состоянии часто является неполным, и клетки приобретают смешанные эпителиальные и мезенхимальные (E/M) характеристики. В недавнем документе Международной ассоциации EMT предлагается описать процесс клеток, проходящих промежуточные E / M фенотипических состояний, как эпителиально-мезенхимальной пластичности (EMP)26. Эта пластичность относится к частичной EMT, гибридный E / M статус, метастабийное состояние EMT, EMT континуум и спектрEMT 26. Во время ЭМТ опухолевые клетки приобретают свойства раковых стволовых клеток (CSC) и становятся более устойчивыми к отслоению индуцированного апоптоза27. В то время как ЭМТ несет ответственность за приобретение инвазивного фенотипа в первичных опухолевых клетках и приводит к прогрессированию рака, напротив, мезенхимально-эпителиальный переход (MET) как было показано, играет важную роль в результате распространения опухолевых клеток на отдаленныхметастатических участках 28,29. Недавнее исследование показало, что ЭМТ полученных клеток рака молочной железы могут быть трансдифференцированы в адипоциты, которые могут предложить возможность ингибировать метастазы и преодолеть устойчивость к терапии в опухолевых клетках ирецидив рака 30. В связи с важной ролью TGF-β сигнализации в активации ЭМТ в канцерогенеза молочной железы, мы представляем подробные протоколы для западного blotting, luciferase транскрипционной репортер анализа, количественные в режиме реального времени-полимеразы цепной реакции (qRT-PCR), и иммунофлюоресценции для исследования TGF-β сигнализации, TGF-β-индуцированной ЭМТ, и трансдифференцирование ЭМТ полученных мамин груди эпителиальных опухолевых клеток в адипоцитов. Эти методы являются наиболее часто используемыми аналитическими инструментами в области клеточной биологии. qRT-PCR используется для обнаружения, характеристики и количественной оценки уровней экспрессии мРНК в количественном выражении. По сравнению с количественным ПЦР (qPCR), альтернативный метод, обратная транскрипция (RT)-PCR может быть использован для определения экспрессиимРНК в полуколичебной манере 31,32. Западный blotting использован для того чтобы рассмотреть специфически уровни протеина в, что дали образце лизата клетки с преимуществами чувствительности и специфичности, в semi-количественном образе. Таким образом, мы представляем систематический рабочий процесс для анализа изменений от экспрессии генов до экспрессии белка, чтобы помочь исследовать TGF-β сигнализации, которые также могут быть применены к другим сигнальным путям.

Protocol

1. Анализ TGF-β SMAD2 фосфорилирования с использованием западного blotting ПРИМЕЧАНИЕ: Предустановка человеческой груди MCF10A-Ras клетки были использованы в качестве примера для исследования TGF-β сигнализацииответы 33. В принципе, описанные ниже методы применимы и к другим линиям клеток TGF-β-го реагирования. Культура груди эпителиальной клеточной линии MCF10A-Ras при 37 градусов по Цельсию в Dulbecco модифицированных Eagle среды (DMEM)/F12, содержащий L-глутамин с 5% лошади сыворотки, 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 10 мг/мл инсулина, 100 нг/мл энтеротоксина холеры, 0,5 мг/мл гидрокортизона и 1:100 пенициллин-стрептомицин (Pen-Strep). Трипсинизировать клетки MCF10A-Ras с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 1 минуты и рассчитывать жизнеспособные клетки с помощью счетчика клеток. Семенные клетки в 6-хорошо пластин при плотности 5× 5клеток / хорошо. После ночного роста, лечить клетки либо TGF-β (5 нг/мл) или лиганд буфер (4 мМ HCl, 0,1% жирных кислот, свободных от крупного рогатого скота альбумин сыворотки (BSA)) в течение 1 часа, а затем удалить культуру среды и аккуратно мыть клетки дважды с 1 мл фосфат-буферного солевого раствора (PBS). Охладить клетки в 6-хорошо пластин на льду и добавить 150 йл предварительно обохлажденной радио иммунной анализа осадков (RIPA) лиза буфера (150 мММ NaCl, 0,1% Тритон X-100, 0,5% деоксихола натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Tris-HCl рН 8,0, и свежеприложенный мини-ингибитор протеазы коктейль). Разрешить лизу продолжать на льду в течение 10 минут. Очистите адепт клетки от тарелки с помощью пластиковой клетки скребок, а затем осторожно передать клеточной подвески в предварительно облеарелую трубку микроцентрифуга. Центрифуга клетки лизать в течение 10 минут при 150 центробежной силе(х г)при 4 градусов по Цельсию и перенести супернатант в свежую микроцентрифугную трубку 1,5 мл. Измерьте концентрацию протеина используя набор анализа протеина совместимого (DC) (DC). Загрузите 30 мкг белка из каждого образца на 10% натрия додекил сульфат полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAGE) гель и запустить гель на напряжение 100 V в течение 1,5-2 часов. Перенесите белки из геля в мембрану 45-мк поливинилиден дифторида (PVDF) при напряжении 110 В в течение 1-1,5 часов. Перенесите мембрану PVDF в соответствующий контейнер со стороной белка (сторона, которая столкнулась с гелем) вверх, и кратко промыть мембрану в дистиллированной воде. Отбросьте воду, добавьте раствор Ponceau S и поставьте мембрану на платформу для качания на 1-2 минуты. Де-пятно мембраны с дистиллированной водой, быстро полоскания его, а затем мыть его в течение 1 минуты. Затем положите мембрану PVDF на световую коробку и сделайте снимок, чтобы проверить на наличие равных общих нагрузок белка. Вымойте мембрану с помощью солевого раствора Tris-buffered с Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl и 0.1% Tween 20) до тех пор, пока не будет видимого окрашивания. Поместите мембрану в блокирующий буфер (5% обезжиренного молока в растворе TBST) и инкубировать его в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте мембрану дважды с TBST. Инкубировать мембрану с первичными антителами против фосфо-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, самодельные 34), всего SMAD2/3 1:1000 и глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH; 1:1000), на ночь при 4 градусов по Цельсию. Вымойте мембрану дважды с TBST и инкубировать мембрану со вторичным антителом против кролика или мыши (1:5000) в течение 2 часов. Инкубировать мембрану PVDF с помощью западного субстрата ECL в течение 30 секунд, и обнаружить сигнал с помощью системы визуализации. Повторите эксперименты по крайней мере три раза, чтобы получить биологические трипликаты. 2. Анализ вызванных TGF-β SMAD3-зависимых транскрипционных ответов Выполните SMAD3/SMAD4-зависимых CAGA12-luciferase транскрипционные репортер анализа. Культура и трипсинизировать клетки MCF10A-Ras, как описано в шаге 1. Семенные клетки в 24-хорошо пластин на 5×104 клеток / хорошо и позволяют клеткам придерживаться на ночь. На следующий день после посева, cotransfect клетки в каждом хорошо с 100 нг TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 люцифераза транскрипционные репортерпостроить 35 и 80 нг β-galactosidase выражение построить с использованием полиэтиленилен (PEI). Для нормализации различий в эффективности β между различными скважинами используется трансинфекция в результате 100-β-галактозидазы. Навестите каждую экспериментальную группу в тройном режиме. После 24 часов инкубации, голодают клетки с сывороткой свободной DMEM-высокой глюкозы и, 6 часов спустя, добавить TGF-β (5 нг/мл) или лиганд буфера (4 мМГ, 0,1% BSA) в качестве управления транспортным средством для клеток. После еще 24 часов инкубации, мыть клетки дважды с довоенным PBS. Добавьте 120 мкл/хорошо 1× лиза буфера и аккуратно встряхните пластину при 4 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Передача 30 мкл лизата в каждую колодец 96-ну белый анализ микропластицы для измерения активности люциферазы с помощью люминометра. Передача 50 мкл лизата в каждую колодец 96-хорошо прозрачной пластины для измерения β-галактозидазы деятельности. Нормализуйте активность люциферазы до β-галактозидазы и повторите эксперименты не менее трех раз для получения биологических трипликатов. Проанализируйте экспрессию TGF-β генов с использованием количественной цепной реакции полимеразы в режиме реального времени (qRT-PCR). Культура и трипсинизировать клетки MCF10A-Ras, как описано в шаге 1. Семенные клетки в 6-хорошо пластин на 5×105 клеток / хорошо и позволяют клеткам придерживаться на ночь. Лечить клетки с TGF-β (5 нг/мл) или лиганд буфер (4 мМН HCl, 0,1% BSA) в течение 6 часов, а затем мыть клетки дважды с 1 мл PBS. Изолировать полную РНК с помощью комплекта изоляции РНК. Определите концентрацию РНК с помощью NanoDrop и выполните синтез кДНК с помощью 1 мкг РНК с помощью первого набора синтеза кДНК. Используйте систему обнаружения ПЦР в режиме реального времени для выполнения количественных ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) с десятикратным разбавленным кДНК в смеси реакции 10 л, которая включает в себя конкретные человеческие форвардные и обратные грунтовки для GAPDH (для нормализации), SERPINE1 (кодирование белка PAI-1, целевой ген TGF-β/SMAD), SMAD7 (целевой ген TGF-β/SMAD) и qPCR Master Mix. Навестите каждую экспериментальную группу в тройном режиме.ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер последовательности, используемые для обнаружения целевых генов человека в qRT-PCR перечислены в таблице 1. Используйте следующие условия реакции qPCR: инициализация, 95 градусов по Цельсию в течение 3 минут; денатурация, 95 градусов по Цельсию в течение 10 секунд; аннеалирование, 60 градусов по Цельсию в течение 30 секунд; и расширение, 80 градусов по Цельсию в течение 10 секунд; денатурация, аннеализация и расширение повторяются 40 раз. Повторите эксперименты по крайней мере три раза, чтобы получить биологические трипликаты. 3. Анализ TGF-β индуцированной скорой МТ Проанализируйте экспрессию маркеров ЭМТ на уровне белка с помощью западного blotting.ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ TGF-β индуцированных EMT показано с помощью мыши NMuMG эпителиальных клеток вкачестве примера 36,37. Культура NMuMG клетки при 37 градусов по Цельсию в DMEM-высокой глюкозы среды дополняется 10% плода бычьей сыворотки и 1:100 Pen-Strep. Используйте методы, описанные в шаге 1 для изоляции и обнаружения белка.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используются следующие антитела: E-кадерин, 1:1000; Н-кадерин, 1:1000; Улитка, 1:1000; Слизняк, 1:1000; Тубулин, 1:1000(рисунок 3). Проанализируйте выражение маркеров EMT на уровне мРНК с помощью количественного ПЦР в режиме реального времени, как описано в шаге 2.2.ПРИМЕЧАНИЕ: Все мышеловки, используемые для qRT-PCR, в том числе CDH1 (кодирование белка E-кадхерин), SNAIL, и ЗЕБ2 (Рисунок 3) перечислены в таблице 1. Проанализируйте процесс ЭМТ с помощью косвенного иммунофлуоресценции и прямого окрашивания флуоресценции. Косвенное окрашивание иммунофлюоресценции Е-кадерин Поместите стерильные 18-мм квадратные стеклянные крышки в 6-хорошо пластин (одна обложка на колодец). Семя 1×105 NMuMG клетки с 2 мл полного DMEM на 6-хорошо пластины и позволяют клеткам придерживаться на ночь. Аккуратно переместите крышки с адептами клеток на новую пластину 6 скважин и добавьте 2 мл среды культуры к колодцам. Лечить клетки с TGF-β (5 нг/мл) или лиганд буфер (4 мМ HCl, 0,1% BSA) в течение 2 дней. Удалите культурную среду и аккуратно промыть клетки дважды с 1 мл довоенной PBS. Исправить клетки, добавив 1 мл 4% параформальдегида и инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно промыть клетки дважды с 1 мл PBS. Permeabilize фиксированных клеток с 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре и мыть клетки дважды с PBS. Блок клетки с 5% BSA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре и мыть клетки дважды с PBS. Добавить первичное антитело против E-кадерин (разбавленный 1:1000 в PBS) в верхней части каждого крышки и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить первичные антитела и мыть крышку с PBS три раза. Добавьте вторичное антитело Alexa Fluor 555 (разбавленное 1:500 в PBS) к верхней части каждого крышки и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре, покрывая алюминиевой фольгой для защиты от света. Удалить вторичное антитело и мыть крышку с PBS три раза. Накрепите крышку (клетки, обращенные вниз) на стеклянные горки с помощью монтажной среды с 4′,6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI) и храните установленные горки в коробке при 4 градусах Цельсия, защищенной от света. Наблюдайте окрашивание конфокальные микроскопии SP8. Прямое флуоресцентное окрашивание нити (F)-актина. Подготовь примеры следующими шагами 3.3.1.1. до 3.3.1.9. Пятно клеток, добавив Alexa Fluor 488 фаллоидин (1:1000) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте, чтобы визуализировать нитевидный актин (F-актин). Вымойте клетки три раза с ПОМОЩЬю PBS. Намонтайте крышку на стеклянные горки с помощью монтажной среды с DAPI и сделайте снимки с помощью конфокаловой микроскопии SP8.

Representative Results

Анализ сигнализации TGF-βКлючевым шагом в TGF-β сигнализации является фосфорилирование двух самых карбокси терминала серин остатков в мотиве SSXS(рисунок 2) по киназы T’RI38,39. Для исследования TGF-β сигнальных реакций, мы выполнили западные blotting фосфорилированных SMAD2. В предмаляющих клетках молочной железы MCF10A-Ras фосфорилирование SMAD2 значительно увеличилось в ответ на стимуляцию TGF-β в течение 1 часа, в то время как выражение общего SMAD2/3 не было затронуто лечением TGF-β(рисунок 4A). С помощью TGF-β-индуцированной SMAD3/4-управляемый CAGA-люк транскрипционные репортер анализа, мы обнаружили, что TGF-β заметно индуцированных люцифераза репортер в MCF10A-Ras клетки линии по сравнению с необработанные клетки (Рисунок 4B). Кроме того, мы заметили, что хорошо охарактеризованные прямые транскрипционные цели генов TGF-β включая SMAD7 и SERPINE1 (кодирование белка PAI-1), были высоко выражены в TGF-β-обработанных клетках MCF10A-Ras(рисунок 4C). Анализ TGF-β индуцированной скорой МТМы оценивали TGF-β индуцированной ЭМТ с различными методами, такими как морфологические изменения, выражение маркеров ЭМТ на уровне мРНК и белка и иммунофлуоресценции окрашивания маркеровСКОРОй 36. Эпителиальные клетки NMuMG, обработанные TGF-β в течение 1 и 2 дней, превратились из классической эпителиальной морфологии в мезенхимальную морфологию в форме шпинделя, о чем свидетельствует фазовая контрастная микроскопия(рисунок 5A). В соответствии с морфологическими изменениями, мы заметили, что лечение TGF-β привело к увеличению экспрессии белка мезенхимальных маркеров, в том числе N-кадерин, улитка,и Слизень 37 (Рисунок 5B). В отличие от этого, E-кадерин, эпителиальный маркер, был downregulated в клетках NMuMG после 2 дней TGF-β(рисунок 5B). Кроме того, мы провели количественную цепную реакцию в режиме реального времени (qRT-PCR) для исследования экспрессии генов маркеров ЭМТ. CDH1 (кодирование белка E-кадхерин) был значительно снижен, в то время как мезенхимальные маркеры, такие как SNAIL и цинковый палец E-коробка связывания homeobox 2 (ЗЕБ2) были заметно увеличены после стимуляции TGF-β в клетках NMuMG по сравнению снеобработанными клетками ( рисунок 5C). TGF-β эмТ в клетках NMuMG была дополнительно подтверждена иммунофлуоресценции окрашивания E-кадерин. При стимуляции TGF-β в течение 2 дней клетки NMuMG выражали меньше E-кадерин, чем клетки в неиндуцированных контрольной группе, проанализированные конфокальной микроскопией(рисунок 5D). Кроме того, клетки NMuMG в присутствии TGF-β образуют больше актиновых стрессовых волокон, о чем свидетельствует конфокаленовая микроскопия(рисунок 5E). SB431542 и GW788388 подавляют TGF-β сигнализацию и TGF-β индуцированной СКОРОйSB431542 является конкурентоспособным ингибитором АТФ в области киназы ТЗРИ, также называют активин рецепторов, как киназы 5 (ALK5), в то время как GW788388 подавляет ТЗРИ и циназы деятельности ТЗРИ. Оба ингибитора могут ингибировать TGF-β рецептор сигнализации40. Таким образом, мы лечили клетки NMuMG с различными концентрациями GW788388 в присутствии TGF-β течение 1 часа. Как и ожидалось, GW788388 ингибирует TGF-β-индуцированного фосфорилирования SMAD2 в дозе зависимой манере(рисунок 6A). Кроме того, TGF-β опосредованное фосфорилирование SMAD2 было заблокировано лечением SB431542(рисунок 6A). Фосфорилированный SMAD2/3 образует гетеромерный комплекс с SMAD4 и транслокирует в ядро, чтобы модулировать транскрипцию генов-мишеней. Поэтому мы исследовали транслокацию SMAD2/3 в клетках NMuMG путем иммунофлуоресценции окрашивания SMAD2/3. Данные показали, что как SB431542, так и GW788388 значительно ингибируют вызванную TGF-β ядерную транслокацию и накопление SMAD2/3 в ячейках NMuMG(рисунок 6B). Кроме того, ингибирующие эффекты SB431542 и GW788388 также наблюдались в уровнях экспрессии мРНК важных генов TGF-β, участвующих в ЭМТ, включая PAI-1, SNAIL, E-кадерин и фибронектин (рисунок 6C). Эти данные свидетельствуют о том, что SB431542 и GW788388 заблокировали TGF-β сигнализацию и TGF-β индуцированной скорой помощью. Анализ трансдифференцирования мезенхимальных раковых клеток молочной железы в адипоцитыЭМТ играет жизненно важную роль в повышении клеточной пластичности при раковых заболеваниях и приводит к развитию резистентности к терапии. Пластичность раковых клеток может быть непосредственно направлена и ингибируется с транс-дифференциации подход, такие как принудительный адипогенез30. Мы использовали Py2T мурин раковые клетки молочной железы, которые были получены из молочной железы мыши молочной опухоли вирус-полиома средней опухоли-антиген (MMTV-PyMT) трансгенной мыши, как клеточная модель ЭМТ-индуцированной пластичной ткани рака. На основе установленногопротокола 41, мы лечили ЭМТ полученных Py2T мурин раковых клеток молочной железы с антидиабетической наркотиков rosiglitazone в течение 10 дней, чтобы вызвать адипогенез. Адипогенез был оценен путем визуализации липидных капель с использованием масляного красного O окрашивания. Толстые клетки были легко обнаружены в rosiglitazone обработанных Py2T мурин раковых клеток молочной железы (Рисунок 7), который показал, что лечение только розиглитазон достаточно для содействия трансдифференцирования ЭМТ полученных клеток рака молочной железы в адипоциты. Рисунок 1: сигнальная сигнализация TGF-β/SMAD. TGF-β сигналит инициирует связывание TGF-β с рецептором TGF-β типа II (T’RII), составно активной киназы, которая фосфорилатирует рецептор TGF-β типа I (T’RI). Затем активируются фосфорилаты киназы ТЗРИ SMAD2/3. Пептид, содержащий мотив SSXS SMAD2 с двумя карбокси терминала фосфорилированных остатков серина был использован для получения поликлональной антисеры признания фосфора-SMAD2 (p-SMAD2). Таким образом, анализ экспрессии p-SMAD2 западным blotting может быть использован для определения активации TGF-β сигнального пути. Фосфорилированный SMAD2/3 может образовывать гетеромерные комплексы с SMAD4, которые затем транслокируются в ядро для модуляции транскрипционных реакций. CAGA12-luciferase репортер анализа и количественного ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) для экспрессии мРНК целевых генов TGF-β, таких как SMAD7 и SERPINE1 (кодирование PAI-1 белка), могут быть использованы для анализа TGF-β-индуцированной SMAD3-зависимых транскрипционных ответов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Схематическая структура R-SMADs (SMAD2 и SMAD3). MH1 (синий) и MH2 (желтый) домены сохранены среди R-SMADs, но область связующим звена (серый) не сохраняется. Mh1 домен SMAD3 гавани ДНК-связывающий мотив, в то время как SMAD2 не может напрямую связать ДНК, из-за вставки (exon 3) в mh1 домена. Домен MH2 опосредует олигомеризацию SMAD, взаимодействие с рецепторами TGF-β и связывание белков и участвует в транскрипционное регулирование. SMAD2 и SMAD3 могут быть активированы фосфорилированием мотива SSXS (красным цветом) в их C termini. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: TGF-β индуцированной скорой МТ. Во время TGF-β индуцированного эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМТ), клетки подвергаются потере эпителия и приобретению мезенхимальных характеристик с повышенной подвижностью клеток и способностью к вторжению. Индукция ЭМТ приводит к выражению мезенхимальных маркеров, таких как N-кадерин, Зеб2 и Snail1/2, а также к снижению эпителиальных маркеров, включая E-кадерин, β-катенин и клаудин-1. Накопившиеся потери или увеличение эпителиальных/мезенхимальных (E/M) характеристик приводит к тому, что клетка вводит промежуточные состояния обратимым образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: TGF-β сигнальные реакции в клетках MCF10A-Ras. (A) MCF10A-Ras клетки лечились либо с или без TGF-β (2,5 нг/мл) в течение 1 часа, и лизолаты клеток были иммуноблотты для фосфорилированных SMAD2 (p-SMAD2), общее SMAD2/3 и GAPDH (в качестве контроля нагрузки). Маркер размера отображается справа. Con: Контрольная группа без лечения TGF-β лечения. (B) Анализ активности TGF-β (5 нг/мл) с использованием транскрипционные репортеры SMAD3-SMAD4-зависимых CAGA12-luciferase (LUC) в клетках MCF10A-Ras. Значения нормализуются для β-галактозидазы (ЗГАЛ). Данные выражаются как среднее ± s.d, n No 3. Студенческий т-тест, No P ≤ 0.001(C) qRT-PCR анализ TGF-β целевых генов SMAD7 и SERPINE1 (кодирование белка PAI-1) в клетках MCF10A-Ras, обработанных TGF-β (2,5 нг/мл) в течение 6 часов. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. Данные выражаются как среднее ± s.d, n No 3. Тест студента, No P ≤ 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: TGF-β индуцированной ЭМТ в клетках NMuMG. (A)Морфология клеток NMuMG, обработанных TGF-β (2,5 нг/мл) в течение 1 или 2 дней. В присутствии TGF-β клетки NMuMG трансдифференцированы в мезенхимальный фенотип. Шкала бар 150 мкм (B) NMuMG клетки были обработаны с или без TGF-β (5 нг/мл) в течение 2 дней, и ЭМТ маркеры были проанализированы западной blotting. Маркер размера указан справа. Con: Контрольная группа без лечения TGF-β лечения. (C)Анализ экспрессии генов маркеровЭМТ (CDH1 (кодирование белка E-кадхерин), SNAIL и ЗЕБ2) в клетках NMuMG, обработанных в течение 2 дней с TGF-β (5 нг/мл). GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. Результаты выражаются как среднее ±, n No 3. Студенческий т-тест, “P ≤ 0,05, “P ≤ 0,01”, “P ≤ 0,001. (D) NMuMG клетки были окрашены иммунофторесценции для обнаружения экспрессии эпителиального маркера E-кадерин (красный) после TGF-β (2,5 нг / мл) лечения в течение 2 дней. Ядра были противоядие с DAPI (синий). Изображения были сняты с помощью конфокального микроскопии. Шкала бар 50 мкм (E) NMuMG клетки были окрашены флуорескин-фаллоидин (зеленый) для визуализации F-актина. Ядра были противоядие с DAPI (синий). Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: TGF-Signaling и TGF-β индуцированной ЭМТ были ингибированы SB431542 и GW788388. (A) NMuMG клетки были обработаны с 10 МКГ SB431542 (SB) или указанные концентрации GW788388 (GW) в присутствии или отсутствии TGF-β (5 нг/мл) в течение 1 часа. Лизаты клеток были иммуноблоттированы для p-SMAD2, SMAD2/3 и GAPDH. (B) NMuMG клетки были обработаны с 5 МКГ SB431542 (SB) или 10 МКГ788388 (ГВт) в присутствии или отсутствии 5 нг / мл TGF-β в течение 1 часа и окрашенных иммунофлуоресценции для обнаружения ядерной транслокации SMAD2/3 (зеленый). Изображения были сняты с помощью конфокального микроскопии. (C) Выражение генов-мишеней TGF-β, включая PAI-1 и гены, кодирующие маркеры СКОРОЙ помощи, включая SNAIL, E-Cadherin и Fibronectin, были проанализированы с помощью обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) в клетках NMuMG после лечения SB или GW и стимуляции TGF-β в течение 48 часов. GAPDH служил в качестве управления погрузкой. Контроль обозначает необработаемые клетки. Эта цифра была изменена из Петерсен М. и др. 34 с разрешения издателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: ЭМТ полученных Py2T мурин раковые клетки молочной железы могут быть вызваны дифференцироваться в адипоциты. Py2T мурин раковые клетки молочной железы были стимулированы с 2 нг / мл TGF-β течение 20 дней, чтобы вызвать полную ЭМТ. Затем, клетки были обработаны либо с DMSO как управление транспортным средством или розиглитазон (2 МК) в течение 10 дней, чтобы дифференциация мезенхимальных раковых клеток и вызвать адипогенез. Среда менялась каждые 2 дня. После 10 дней лечения, клетки были окрашены в масляный красный O. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. вид Имя гена Форвард (5′ к 3′) Обратный (5′ до 3′) человеческий ГАДДХ TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG СЕРПИН1 КАКААААТКАГКАГГАКПАКАКТ CATCGGGCGTGGTGAACTC мышь ГАДДХ TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC ГАГААТГТТТГГКААТГГ улитка CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA ЗЕБ2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCATCAT Таблица 1: Праймеры, используемые для qRT-PCR.

Discussion

TGF-β/SMAD сигнализации играет ключевую роль в прогрессировании рака молочной железы, так как это может способствовать инвазивности клеток рака молочной железы и метастазов, вызывая EMT7. Здесь мы описали логический рабочий процесс для исследования TGF-β инициированной сигнализации от индуцированной рецепторами активации SMAD к транскрипционным и биологическим ответам SMAD. Мы начали с описания анализа фосфорилирования SMAD2, продолжили TGF-β-индуцированные SMAD3-зависимые транскрипционные реакции и экспрессию маркера EMT как на уровне генов, так и белков для анализа сигнальной реакции TGF-β/SMAD, и, наконец, изучили TGF-β-индуцированной СКОРОЙ. Мы использовали CAGA12-luciferaseтранскрипционные репортер, содержащий коробки CAGA, полученные от промоутера PAI-1, для мониторинга деятельности TGF-β/SMAD сигнальныйпуть 35. Эта конструкция репортера требует активации SMAD3 и SMAD4. Предыдущие исследования показали, что нокдаун SMAD4 attenuated TGF-βиндуцированной CAGA 12-люциферазадеятельности 37. В дополнение к анализу репортера, определение состояния фосфорилирования эндогенных SMADs, в том числе SMAD2 и SMAD3, является еще одним способом исследовать TGF-β сигнализации ответ. Действительно, другие члены семьи TGF-β, такие как фактор роста и дифференциации (GDF)-8/myostatin и GDF-9, также трансдуцовые сигналы через белки SMAD2/3, привлекая T’RI42,43,44. В дополнение крепортеру CAGA 12-luciferase, несколько подобных репортеров были использованы для обнаружения активации TGF-β сигнализации. Например, транскрипционные (SBE)4-Lux репортер с элементами ответа, полученных от промоутера JunB может быть эффективно индуцированных TGF-β, активинов и BMPs45.

Западные blotting и qPCR были использованы для анализа TGF-β-индуцированной ЭМТ, которые являются классическими методами для исследования выражения эпителиальных маркеров (т.е. E-кадхерин) и мезенхимальных маркеров (т.е. N-кадерин, улитка, слизень и зеб2). Мы также выполнили косвенное окрашивание иммунофлюоресценции Е-кадерин и прямое флуоресцентного окрашивания F-актаина. Эти анализы еще больше подтвердили мезенхимальный фенотип клеток после лечения TGF-β лечения. Ограничение иммунофлуоресценции окрашивания является то, что клетки должны быть исправлены до инкубации с антителами и изображений, и трудно исследовать изменения в экспрессии маркера ЭМТ в живых клетках. В последнее время, дизайн EMT репортер клеточных линий, таких как A549 аденокарциномы легких-виментин-RFP, сделал возможным контролировать преобразование эпителиальных клеток мезенхимальных клеток в режиме реального времени через выражение красного флуоресцентного белка (RFP) помечены виментина. Эта платформа может быть использована для скрининга наркотиков и разработки новых лекарств46. LifeAct краситель, 17-аминокислотный пептид, который может пятно F-актин структур в живых клетках, становится ценным инструментом для визуализации актин цитоскелет в режиме реального времени, не вмешиваясь в клеточныепроцессы 47. В этом исследовании мы использовали два малых молекул ингибиторы, SB431542 и GW788388, чтобы проверить их ингибирующее воздействие на TGF-β сигнализации и TGF-β-индуцированной ЭМТ. Примечательно, что GW788388 сильно подавляет активность ТЦРИ и ТЦРИИ, в то время как SB431542 имеет ингибирующее действие только на ТРИ (и ALK4 и ALK7). Предыдущие исследования показали, что GW788388 является более мощным in vivo, чем SB43154240. В дополнение к ингибированию ЭМТ, GW788388 снижение экспрессии фиброзных маркеров в почках, и устное введения GW788388 у диабетических мышей заметно снизилась гломерулопатия25,48.

EMT играет важную роль в содействии пластичности раковых клеток и приводит к лекарственной устойчивости и метастазы 49. Таким образом, ориентация клеток, полученных из ЕМТ с конкретнымицитотоксическими препаратами 50 или индуцирующей редифференцирование с помощью мезенхимального к эпителиального перехода (MET)51, была предложена в качестве подхода к преодолению метастазов раковых клеток и резистентности к терапии. Тем не менее, MET способствует распространению рассеянных раковых клеток в отдаленныхорганах 52, которые могут быть контрпродуктивными при использовании терапевтической реверсии ЭМТ. Недавно новое исследование сообщило о терапевтическом подходе трансдифференцирования, непосредственно ориентируясь на клетки рака молочной железы, полученные из ЭМТ, для дифференциации наадипоциты 30. Исследование Ишай-Ронен и др. al.30 использовали эпителиальные раковые клетки Py2T murine, которые подверглись переходу на мезенхимальные клетки в ответ на длительное лечение TGF-β. Они продемонстрировали, что розиглитазон в сочетании с ингибиторами МЭК усиливает эпителиалитную дифференциацию и адипогенез. Тем не менее, мы обнаружили, что розиглитазон только было достаточно, чтобы вызвать трансдифференцирование мезенхимальных клеток py2T мурина в адипоциты.

Таким образом, методы, используемые в данном исследовании, обеспечили логический рабочий процесс для исследования TGF-β сигнализации и TGF-β индуцированной скорой помощи. Два ингибитора, SB431542 и GW788388, могут блокировать TGF-β индуцированные ответы и ЭМТ. Кроме того, мы также продемонстрировали розиглитазон только вызывает адипогенез в некоторых TGF-β индуцированных мезенхимальных раковых клеток молочной железы. Хотя мы использовали только несколько линий раковых клеток молочной железы для исследования TGF-β ответов, методы, описанные здесь, могут быть экстраполированы на другие (раковые) клетки. Здесь мы использовали различные концентрации TGF-β, чтобы вызвать клеточные реакции. В большинстве типов клеток TGF-β оказывает свою биологическую активность в диапазоне концентрации 0,01-10 нг/мл53 и вызывает сигнализацию в структуре реакции дозы. В первичных эндотелиальных клетках, включая аортальные эндотелиальные клетки крупного рогатого скота, TGF-β индуцировал существенное выражение фосфорилированного SMAD2 на уровне 0,025 нг/мл, достиг максимума в 0,25 нг/мл и оставался на этом уровне в ответ наболее высокие концентрации 53. В нашем исследовании мы использовали высокую концентрацию TGF-β (5 нг/мл) в клетках MCF10A-Ras для анализа транскрипционного репортера, чтобы получить сильные ответы. Фосфорилирование SMAD2 и экспрессия генов-мишеней могут быть вызваны TGF-β в низкой дозе; таким образом, мы использовали 2,5 нг/мл TGF-β для лечения клеток. Однако наиболее подходящая рабочая концентрация зависит от типа клетки и предполагаемых эффектов. Для определения наилучшей концентрации TGF-β, лечение клеток с различными дозами (от низких до высоких) рекомендуется.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем поддержку Китайского стипендиального совета (CSC) j.З. и Центра геномики рака Нидерландов (CGC. NL) в P.t.D.

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Ricerca sul cancro. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Ricerca sul cancro. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Ricerca sul cancro. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

TGF-betaEpithelial-to-mesenchymal Transition (EMT)Breast CancerNMuMG CellsE-cadherinF-actinCell MigrationCell InvasionMetastasisChemotherapy ResistanceIndirect Immunofluorescent StainingCell Density

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image