JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

دراسة TGF-β الإشارة و TGF-β الناجمة عن الظهارية إلى mesenchymal التحول في سرطان الثدي والخلايا الطبيعية

Published: October 27, 2020
doi:
10.3791/61830
, , , ,
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology,Leiden University Medical Center

Summary

نحن وصف سير العمل المنهجي للتحقيق TGF-β إشارات وTGF-β الناجمة عن EMT من خلال دراسة التعبير البروتيني والمورثات المشاركة في هذا المسار إشارة. وتشمل هذه الطرق النشاف الغربية، ومقايسة مراسل لوسيفراز، وqPCR، وتلطيخ المناعة.

Abstract

تحويل عامل النمو β (TGF-β) هو عامل متعدد الوظائف المفرزة التي تلعب دورا رئيسيا في الاتصالات بين الخلايا. يمكن أن تؤدي الانزعاجات من إشارات TGF-β إلى الإصابة بسرطان الثدي. TGF-β يثير آثاره على الانتشار والتمايز عبر سطح الخلية محددة TGF-β نوع I و مستقبلات النوع الثاني (أي TβRI و TβRII) التي تحتوي على مجال داخلي serine / threonine كيناز. بناء على تشكيل مجمع غير اتيروتي مستحث β TGF، يقوم TβRI المنشط بإثارة الإشارات داخل الخلايا بواسطة الفوسفور SMAD2 وSMAD3. هذه SMADs تنشيط تشكيل مجمعات غير متجانسة مع SMAD4 لتنظيم الجينات المستهدفة محددة, بما في ذلك مثبط تنشيط البلازمينوجين 1 (PAI-1, ترميز من قبل الجين SERPINE1). إن تحريض الانتقال الظهاري إلى الظهارية (EMT) يسمح للخلايا السرطانية الظهارية في الموقع الأساسي أو أثناء الاستعمار في مواقع بعيدة للحصول على نمط ظاهري غازي ودفع تطور الورم. TGF-β بمثابة محفز قوي لغزو سرطان الثدي من خلال قيادة EMT. هنا، نحن وصف أساليب منهجية للتحقيق TGF-β الإشارات والاستجابات EMT باستخدام ما قبل التهانينات البشرية MCF10A-RAS (M2) الخلايا والماوس NMuMG الظهارية الخلايا كمثال. نحن وصف أساليب لتحديد TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور بواسطة النشاف الغربية، SMAD3/SMAD4-تعتمد على نشاط النسخ باستخدام نشاط المراسل luciferase والتعبير الجيني SERPINE1 الهدف بواسطة كمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR). بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف أساليب لفحص EMT الناجم عن β TGF عن طريق قياس التغيرات في مورفولوجيا، تعبير علامة الظهارية والميسنشية، التلطيخ الخيوط والثبوت المناعي من الفلوروسين E-cadherin. تم استخدام اثنين من الجزيء الصغير الانتقائي TGF-β مثبطات كيناز مستقبلات, GW788388 و SB431542, لمنع TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور, الجينات المستهدفة والتغيرات في التعبير علامة EMT. وعلاوة على ذلك، فإننا وصف لتمايز الثدي mesenchymal Py2T مورين الخلايا السرطانية الظهارية إلى adipocytes. قد تساهم طرق فحص الإشارات الناجمة عن β TGF وEMT في سرطان الثدي في اتباع نهج علاجية جديدة لسرطان الثدي.

Introduction

السيتوكين تحويل عامل النمو β (TGF-β) هو النموذج الأولي لمجموعة كبيرة من هيكليا ووظيفيا ذات الصلة polypeptides التنظيمية بما في ذلك TGF-βs (أي، TGF-β1، -β2 و-β3)، وبروتينات مورفوجينيك العظام (BMPs) وactivins1،2. هذه السيتوكينات تلعب جميعها أدوارا هامة في التنمية الجنينية وفي الحفاظ على الأنسجة والأعضاء3. سوء تنظيم TGF-β يمكن أن يؤدي إلى مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأمراض، بما في ذلك السرطان4،5. TGF-β يلعب معقدة, دور مزدوج في تطور السرطان: في الخلايا الظهارية العادية وpremalignant, TGF-β يتصرف كما القامع الورم عن طريق تثبيط انتشار وحفز المبرمج6,7; ومع ذلك، في مرحلة متأخرة من تطور الورم، عندما يتم حظر الاستجابات cytostatic عن طريق تنشيط أونكوجيني أو فقدان الجينات القامع الورم، TGF-β بمثابة محسن الورم من خلال تعزيز انتقال الظهارة إلى النخاع (EMT) في الخلايا السرطانية، مما يتيح غزو الخلايا السرطانية والنقائل، والعمل على الخلايا في البيئة الدقيقة الورم، وتحفيز تولد الأوعية والتهرب المناعي8،9،10.

ويفرز TGF-β كجزيء السلائف غير نشط التي تحتوي على ناضجة carboxy الطرفية TGF-β والببتيد الكمون المرتبطة (LAP)11. يمكن ربط هذا المركب الصغير ببروتين TGF-β ملزم (LTBP)12. ويمكن الافراج عن ناضجة TGF-β يمكن أن توسطت من قبل عمل proteases محددة أن ينشق LAP أو عن طريق سحب الميكانيكية من LAP في عملية تعتمد على integrin13,14. بالإضافة إلى LTBP، Glycoprotein التكرار السائدة (GARP) وأعرب عن ذلك بشدة على سطح الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ويلعب دورا مماثلا كما LTBP في تنظيم تفعيل TGF-β15،16. يرتبط GARP مباشرة بـ TGF-β من خلال ربط ثنائي الكبريت والرابطة غير التكافؤية. يتطلب تفعيل TGF-β من مجمع GARP/TGF-β integrins17. ناضجة TGF-β يربط إلى مستقبلات TGF-β سيرين/ثريونين كيناز، أي، TGF-β النوع الأول (TβRI) و TGF-β نوع II (TβRII) مستقبلات18 لبدء الإشارة. إن ربط β TGF إلى TβRII يعزز توظيف TβRI وتشكيل مجمع غير اتيروي. في وقت لاحق، هو phosphorylated TβRI بواسطة kinase TβRII على المخلفات سيرين وهرونين في قصيرة جليكين- وsiine الغنية (GS) عزر، مما أدى إلى تفعيلها19،20. عند التنشيط، يتم تنشيط TβRI المجندين وفسفوريلات ركائزها: SMADs الخاصة بمستقبلات محددة (R-SMADs) التي تشمل SMAD2 و SMAD3(الشكل 1). R-SMADs حصة هيكل عام مماثل مع اثنين من ما يسمى مجالات جنون homology، MH1 و MH2، التي يتم فصلها من قبل منطقة رابط الغنية برولين(الشكل 2). لا يتم حفظ عزر ربط الحمض النووي ضمن المجال MH1 من SMAD3 بين SMAD2 و SMAD3، ولا يمكن ربط SMAD2 مباشرة الحمض النووي بسبب وجود اثنين من الإدراجات في مجال MH1 الخاص به (exon 3 و L1). SMAD2 وSMAD3 يمكن تفعيلها بواسطة الفوسفور من عزر SSXS في بهم C-termini(الشكل 2). الفوسفور SMAD2/3 أشكال المجمعات غير اتيرتي مع وسيط SMAD المشتركة، SMAD4، الذي يحول إلى نواة لتعديل النسخ من الجينات المستهدفة (الشكل 1)7,21. وينظم هذا المسار إشارة SMAD الكنسي بدقة ويولد استجابات محددة الخلوية والأنسجة مثل تنظيم مصير الخلية و ورم الخلايا الانبثاث والغزو22. بالإضافة إلى TGF-β-SMAD الإشارات، غير SMAD إشارات المسارات يمكن أيضا أن تكون مباشرة تنشيط المستقبلات لتنظيم الردود الخلوية المصب23.

أثناء تطور الورم، هناك حاجة إلى تنشيط مسارات TGF-β التي تعتمد على SMAD والمستقلة عن SMAD من أجل حث EMT. EMT هي عملية قابلة للعكس حيث تُزيل الخلايا السرطانية من النمط الظاهري الظهاري، والذي يرتبط بفقدان اتصالات الخلية وانخفاض قطبية apical-القاعدية، إلى نمط ظاهري ميثيني مع تعزيز الحركة والقدرة على الغزو24. يتميز EMT بزيادة التعبير عن بروتينات علامة الميزينشيمال ، بما في ذلك N-cadherin و vimentin وZeb2 و Snail11 /2 ، وما يصاحب ذلك من downregulation لعلامات الظهارية ، مثل e-cadherin و β – catenin (الشكل 3)25. ومع ذلك، الانتقال من الظهارية إلى حالة mesenchymal غالباً ما تكون غير مكتملة، والخلايا تكتسب خصائص الظهارية المختلطة وميزينشيمال (E/M). ورقة حديثة من قبل الرابطة الدولية EMT اقترح لوصف عملية الخلايا التي تمر دول متوسطة E / M فيينوتبيك كما الظهارية -mesenchymal اللدونة (EMP)26. هذه اللدونة تشير إلى EMT جزئية، حالة E/M الهجينة، حالة EMT ميتابل، سلسلة EMT وطيف EMT26. خلال EMT، الخلايا السرطانية تكتسب خصائص الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وتصبح أكثر مقاومة للزواصات المبرمج الناجم عن مفرزة27. في حين أن EMT هي المسؤولة عن الحصول على النمط الظاهري الغازية في الخلايا السرطانية الأولية ويدفع تطور السرطان، في المقابل، وقد ثبت أن الانتقال mesenchymal-الظهارية (MET) تلعب دورا هاما في الخروج من الخلايا السرطانية نشرها في مواقع النقيلي بعيد28،29. أظهرت دراسة حديثة أن خلايا سرطان الثدي المستمدة من EMT يمكن أن تكون متمايزة إلى الخلايا الشحمية ، والتي قد توفر فرصة لمنع الانبثاث والتغلب على مقاومة العلاج في الخلايا السرطانية والسرطان الانتكاس30. نظرا للدور الهام لTGF-β الإشارات في تفعيل EMT في سرطان الثدي، نقدم بروتوكولات مفصلة لنشاف الغربية، وهو مقول النسخ luciferase مقايسة، الكمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR)، ومناعة منابع للتحقيق من TGF-β الإشارات، TGF-β الناجمة عن EMT، وtrans-differentiation من الخلايا الثدي الظهارية المورين المستمدة EMT إلى الخلايا الدهنية. هذه التقنيات هي الأدوات التحليلية الأكثر استخداما في مجال بيولوجيا الخلية. يتم استخدام qRT-PCR للكشف عن مستويات التعبير في الرنا وتمييزها وقياسها بطريقة كمية. بالمقارنة مع PCR الكمية (qPCR)، تقنية بديلة، النسخ العكسي (RT)-PCR يمكن استخدامها لتحديد التعبير مرنا بطريقة شبه كمية31،32. يستخدم النشاف الغربي لفحص مستويات بروتينية محددة في عينة خلية معينة مع مزايا الحساسية وخصوصية، بطريقة شبه كمية. وهكذا، نقدم سير عمل منهجي لتحليل التغيرات من التعبير الجيني إلى تعبير البروتين للمساعدة في التحقيق في إشارة TGF-β التي يمكن تطبيقها أيضًا على مسارات الإشارات الأخرى.

Protocol

1. تحليل من TGF-β الناجمة SMAD2 الفوسفور باستخدام النشاف الغربية ملاحظة: تم استخدام خلايا MCF10A-رأس الثدي الإنسان premalignant كمثال للتحقيق في الاستجابات إشارة TGF-β33. من حيث المبدأ، الطرق الموضحة أدناه تنطبق أيضاً على خطوط الخلايا الأخرى TGF-β المستجيبة. ثقافة الثدي خط الخلية الظهارية MCF10A-راس في 37 درجة مئوية في متوسطة النسر (DMEM) /F12 Dulbecco تعديل تحتوي على L-الجلوتامين مع 5٪ مصل الحصان، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF), 10 ملغ / مل الأنسولين, 100 نانوغرام / مل الكوليرا enterotoxin, 0.5 ملغم / مل هيدروكورتيزون, و 1:100 البنسلين-الستربتوميسين (القلم-ستريب). حاول أن تُستخدم خلايا MCF10A-رأس مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة دقيقة واحدة و حساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام عداد خلية. بذور الخلايا في 6-صحن في كثافة 5×105 الخلايا/جيدا. بعد نمو بين عشية وضحاها، علاج الخلايا مع إما TGF-β (5 نانوغرام /مل) أو العازلة ليغاند (4 mM HCl، 0.1٪ الدهنية حمض خالية من الزمن الألبومين المصل (BSA)) لمدة 1 ساعة، ومن ثم إزالة ثقافة المتوسطة وغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). خلايا باردة في 6-آبار لوحات على الجليد وإضافة 150 ميكرولتر من قبل التبريد اختبار مناعية ترسيب (RIPA) العازلة تحلل (150 mM NaCl، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5٪ ديوكسيتشولات الصوديوم، 0.1٪ SDS، 50 mM تريس-HCl pH 8.0، وأضاف حديثا مصغرة مثبطات البروتين كوكتيل). السماح للتحلل للمضي قدما على الجليد لمدة 10 دقائق. كشط الخلايا الملتصية قبالة الطبق باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية، ثم نقل بلطف تعليق الخلية إلى أنبوب microcentrifuge المبردة مسبقا. الطرد المركزي الخلية lysate لمدة 10 دقيقة في قوة الطرد المركزي 150 (ز )في 4 درجة مئوية ونقل سوبرنات إلى أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge. قياس تركيز البروتين باستخدام المنظفات متوافقة (DC) مجموعة من البروتين فحص. تحميل 30 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على 10٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات هلام 1.5-2 ساعات. نقل البروتينات من هلام إلى 45-μm بولي فينيلايدين difluoride (PVDF) غشاء في الجهد من 110 V لمدة 1-1.5 ساعة. نقل غشاء PVDF في وعاء مناسب مع الجانب البروتين (الجانب الذي كان يواجه الجل) حتى، وشطف لفترة وجيزة الغشاء في الماء المقطر. تجاهل الماء، إضافة بونساو S الحل، ووضع الغشاء على منصة هزاز لمدة 1-2 دقيقة. إزالة وصمة عار الغشاء مع الماء المقطر عن طريق الشطف بسرعة ومن ثم غسله لمدة 1 دقيقة. ثم، وضع غشاء PVDF على مربع الضوء، واتخاذ صورة للتحقق من الأحمال البروتين الكلي على قدم المساواة. اغسل الغشاء مع محلول ملحي ثلاثية التخزين مع Tween 20 (TBST، 20 mM تريس-HCl، 7.4، 150 mM NaCl، و 0.1٪ توين 20) حتى لا يكون هناك تلطيخ مرئي. وضع الغشاء في عازلة منع (5٪ الحليب المقشود في حل TBST) واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الغشاء مرتين مع TBST. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية ضد فوسفو-SMAD2 (ف-SMAD2; 1:1000, منزلي الصنع 34),مجموع SMAD2/3 1:1000 وغليسيرالدهيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH; 1:1000), بين عشية وضحاها في 4 °C. غسل الغشاء مرتين مع TBST واحتضان الغشاء مع جسم مضاد الثانوية ضد أرنب أو فأر (1:5000) لمدة 2 ساعة. احتضان غشاء PVDF مع الركيزة ECL الغربية لمدة 30 ثانية، والكشف عن إشارة باستخدام نظام التصوير. كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات بيولوجية. 2. تحليل الاستجابات النسخية التي تعتمد على SMAD3 التي β TGF تنفيذ SMAD3/SMAD4 التابعة CAGA12-luciferase مقايسة مراسل النسخ. الثقافة و trypsinize MCF10A-رأس الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1. خلايا البذور في لوحات 24-جيدا في 5×104 خلايا / جيدا والسماح للخلايا للتمسك بين عشية وضحاها. في اليوم التالي البذر، cotransfect الخلايا في كل بئر مع 100 نانوغرام من TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 لوسيفيراز النسخي بناءمراسل 35 و 80 نانوغرام من β-galactosidase بناء التعبير باستخدام polyethylenimine (PEI). يتم استخدام نقل β-galactosidase لتطبيع الاختلافات في كفاءة نقل بين الآبار المختلفة. إعداد كل مجموعة تجريبية في ثلاث ية. بعد 24 ساعة من الحضانة, تجويع الخلايا مع الدم خالية DMEM-high الجلوكوز, 6 ساعات في وقت لاحق, إضافة TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ليغاند (4 M HCl, 0.1٪ BSA) كتحكم في السيارة إلى الخلايا. بعد 24 ساعة أخرى من الحضانة ، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني مُثلج الدفء. أضف 120 ميكرولتر/بئر 1× عازلة للتحلل واهز الطبق برفق عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. نقل 30 ميكرولتر من lysate إلى كل بئر من 96 جيدا بيضاء المقايسة الصغيرة لقياس نشاط لوسيفراز باستخدام مضيئة. نقل 50 ميكرولتر من lysate إلى كل بئر من لوحة شفافة 96 جيدا لقياس β-galactosidase النشاط. تطبيع النشاط luciferase إلى النشاط β galactosidase وتكرار التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات البيولوجية. تحليل التعبير عن الجينات الهدف TGF-β باستخدام كمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة التفاعل (qRT-PCR). الثقافة و trypsinize MCF10A-رأس الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1. خلايا البذور في لوحات 6-جيدا في 5×105 خلايا / جيدا والسماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها. علاج الخلايا مع TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ليغاند (4 mM HCl، 0.1٪ BSA) لمدة 6 ساعات، ثم غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة عزل RNA. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي مع NanoDrop وتنفيذ التوليف cDNA مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام أول خيطاً cDNA التوليف كيت. استخدام نظام الكشف في الوقت الحقيقي PCR لتنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) مع عشرة أضعاف cDNA المخفف في خليط تفاعل 10 ميكرولتر التي تشمل محددة الإنسان إلى الأمام والأقراص التمهيدية العكسي لDEDH (للتطبيع)، SERPINE1 (ترميز بروتين PAI-1، الجين المستهدف TGF-β/SMAD)و SMAD7 (الجين المستهدف TGF-β/SMAD) و QPCR Master Mix. إعداد كل مجموعة تجريبية في ثلاث ية.ملاحظة: التسلسلات التمهيدية المستخدمة للكشف عن الجينات البشرية المستهدفة في qRT-PCR مدرجة في الجدول 1. استخدام حالات رد فعل qPCR التالية: التهيئة, 95 ° C لمدة 3 دقائق; denaturation، 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان؛ التشبث، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ والامتداد، 80 درجة مئوية لمدة 10 ثوان؛ يتم تكرار التكفير والحنيع والامتداد 40 مرة. كرر التجارب ثلاث مرات على الأقل للحصول على ثلاث مرات بيولوجية. 3. تحليل EMT الناجم عن β TGF تحليل التعبير عن علامات EMT على مستوى البروتين باستخدام النشاف الغربية.ملاحظة: يتم عرض تحليل EMT الناجم عن β TGF باستخدام الخلايا الظهارية NMuMG ماوس كمثال36،37. ثقافة NMuMG الخلايا في 37 درجة مئوية في DMEM عالية الجلوكوز المتوسطة تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين و 1:100 القلم-ستريب. استخدام الطرق الموضحة في الخطوة 1 لعزل البروتين واكتشافه.ملاحظة: الأجسام المضادة التالية تستخدم في هذه التجربة: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; الحلزون، 1:1000؛ سبيكة، 1:1000؛ توبولين، 1:1000 (الشكل 3). تحليل التعبير عن علامات EMT على مستوى مرنا باستخدام كمية في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في الخطوة 2.2.ملاحظة: جميع الفارات الماوس المستخدمة لqRT-PCR، بما في ذلك CDH1 (ترميز البروتين E-cadherin)، الحلزون، وZEB2 (الشكل 3)مدرجة في الجدول 1. تحليل عملية EMT باستخدام الفلوروسينة المناعية غير المباشرة وتلطيخ الفلوروسين المباشر. صبغ الفلوروس المناعي غير المباشر لـ E-cadherin مكان معقمة 18 مم الجانب الزجاج المربع يغطي في لوحات 6-جيدا (واحد coverslip لكل بئر). البذور 1×105 NMuMG الخلايا مع 2 مل من DMEM كاملة لكل لوحة 6-جيدا والسماح للخلايا للتمسك بين عشية وضحاها. نقل بلطف الأغطية مع الخلايا المضمّنة إلى لوحة جديدة 6-جيدا وإضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة إلى الآبار. علاج الخلايا مع TGF-β (5 نانوغرام / مل) أو العازلة ligand (4 M HCl، 0.1٪ BSA) لمدة 2 أيام. إزالة المتوسطة الثقافة وغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مسبق. إصلاح الخلايا بإضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde والتحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. Permeabilize الخلايا الثابتة مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. منع الخلايا مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد e-cadherin (المخفف 1:1000 في برنامج تلفزيوني) إلى أعلى كل غطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجسام المضادة الأساسية وغسل الغطاء مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. أضف الأجسام المضادة الفلورة 555 الثانوية (المخففة 1:500 في برنامج تلفزيوني) إلى أعلى كل غطاء واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تغطية مع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل الغطاء مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. جبل الغطاء (الخلايا التي تواجهها إلى أسفل) على الشرائح الزجاجية باستخدام تصاعد المتوسطة مع 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) وتخزين الشرائح التي شنت في مربع في 4 °C، محمية من الضوء. مراقبة تلطيخ مع SP8 المجهرية confocal. تلطّخ الفلوري المباشر من خيوط (F)-actin. إعداد العينات التالية الخطوات 3.3.1.1. إلى 3.3.1.9. وصمة عار الخلايا بإضافة اليكسا فلور 488 Phalloidin (1:1000) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتصور actin خيوط (F-actin). غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. قم بتركيب الغطاء على الشرائح الزجاجية باستخدام متوسط التركيب مع DAPI وخذ الصور باستخدام المجهر السفلي SP8.

Representative Results

تحليل إشارات TGF-βالخطوة الرئيسية في TGF-β الإشارات هو الفوسفور من اثنين من معظم المخلفات سيرين محطة carboxy في عزر SSXS(الشكل 2)بواسطة TβRI كيناز38,39. للتحقيق في الاستجابات إشارة TGF-β، قمنا بتنفيذ النشاف الغربي من SMAD2 الفوسفورية. في ما قبل النيانت الثدي الإنسان MCF10A-راس الخلايا، والفوسفور من SMAD2 زيادة كبيرة استجابة لتحفيز TGF-β لمدة 1 ساعة، في حين أن التعبير عن مجموع SMAD2/3 لم تتأثر TGF-β العلاج(الشكل 4A). باستخدام SMAD3/4-يحركها SMAD-β SMAD3/4-يحركها CAGA لوك النسخي مقايسة, وجدنا أن TGF-β تسبب بشكل ملحوظ مراسل لوسيفيراز في خط الخلايا MCF10A-رأس مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن جيدا تتميز أهداف الجينات النسخي المباشر من TGF-β بما في ذلك SMAD7 وSPASPINE1 (ترميز البروتين PAI-1)، وأعرب عنها بشدة في TGF-β المعالجة MCF10A-راس خلايا(الشكل 4C). تحليل EMT الناجم عن β TGFقمنا بتقييم نظام EMT الناجم عن β TGF بأساليب مختلفة، مثل التغيرات المورفولوجية، والتعبير عن علامات EMT في الـ MRNA ومستويات البروتين وتلوّع الفلوروس المناعي لعلامات EMT36. NMuMG الخلايا الظهارية تعامل مع TGF-β لمدة 1 و 2 أيام تغيرت من مورفولوجيا الظهارية الكلاسيكية إلى مورفولوجيا مثل المانسكيلية على شكل مغزل، كما هو مبين في المجهر النقيض المرحلة(الشكل 5A). بما يتفق مع التغيرات المورفولوجية، لاحظنا أن العلاج TGF-β أدى إلى زيادة في التعبير البروتيني لعلامات mesenchymal، بما في ذلك N-cadherin، الحلزون، وSdd37(الشكل 5B). في المقابل، E-cadherin، علامة الظهارية، كان downregulated في الخلايا NMuMG بعد 2 أيام من العلاج TGF-β(الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بإجراء تفاعل سلسلة البوليميراز في الوقت الحقيقي الكمي (qRT-PCR) للتحقيق في التعبير الجيني لعلامات EMT. CDH1 (ترميز بروتين E-cadherin) انخفض بشكل ملحوظ، في حين أن علامات mesenchymal مثل الحلزون والزنك الإصبع E-مربع ملزمة homeobox 2 (ZEB2) تم زيادة ملحوظة بعد التحفيز TGF-β في الخلايا NMuMG مقارنة بالخلايا غير المعالجة(الشكل 5C). تم تأكيد EMT الناجم عن β TGF في خلايا NMuMG كذلك عن طريق تلطيخ الفلوروست المناعية من E-cadherin. على التحفيز TGF-β لمدة 2 أيام، أعرب خلايا NMuMG أقل E-cadherin من الخلايا في مجموعة التحكم غير المستحثة، كما تم تحليلها بواسطة المجهر confocal (الشكل 5D). وعلاوة على ذلك، شكلت الخلايا NMuMG في وجود TGF-β أكثر ألياف الإجهاد actin، كما هو مبين من قبل المجهر confocal (الشكل 5E). SB431542 و GW788388 تمنع TGF-β إشارات و EMT الناجمة عن β TGFSB431542 هو مثبط ATP تنافسية من مجال كيناز من TβRI، كما يطلق عليه activin مستقبلات مثل كيناز 5 (ALK5)، في حين GW788388 يمنع TβRI و TβRII كيناز النشاط. كل من مثبطات يمكن أن تمنع مستقبلات β TGF مما يشير40. وهكذا، تعاملنا مع الخلايا NMuMG مع تركيزات مختلفة من GW788388 في وجود TGF-β لمدة 1 ساعة. كما هو متوقع، GW788388 منعت TGF-β الناجمة عن SMAD2 الفوسفور بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 6A). بالإضافة إلى ذلك، تم حظر الفسفور بوساطة TGF-β SMAD2 من قبل SB431542 العلاج (الشكل 6A). يشكل SMAD2/3 الفوسفوري مركبًا غير متغاير مع SMAD4 ويتحول إلى النواة لتعديل نسخ الجينات المستهدفة. لذلك، قمنا بالتحقيق في نقل SMAD2/3 في خلايا NMuMG عن طريق تلطيخ الفلوروس من مناعة SMAD2/3. وأظهرت البيانات أن كلا من SB431542 وGW788388 منعت بشكل كبير نقل β النووية الناجمة عن TGF وتراكم SMAD2/3 في الخلايا NMuMG(الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، لوحظت الآثار المثبطة لSB431542 وGW788388 أيضا في مستويات التعبير مرنا من الجينات الهامة TGF-β الهدف المشاركة في EMT، بما في ذلك PAI-1، SNAIL، E-cadherin وFenectin (الشكل 6C). وتشير هذه البيانات إلى أن SB431542 وGW788388 منعت TGF-β إشارات وTGF-β الناجمة عن EMT. تحليل تغاير خلايا سرطان الثدي الحامشية إلى الخلايا الشحميةيلعب EMT دورًا حيويًا في تعزيز اللدونة الخلوية في حالات السرطان ويؤدي إلى تطوير مقاومة العلاج. يمكن استهداف اللدونة الخلايا السرطانية بشكل مباشر وتثبيطها باستخدام نهج التمايز العابر ، مثل النشوء القسري30. استخدمنا Py2T مورين خلايا سرطان الثدي، والتي كانت مستمدة من الغدة الثديية من ورم فأر ماماري فيروس الورم الوسطى-بوليوما مستضد (MMTV-PyMT) الماوس المعدلة وراثيا، كنموذج خلوي من اللدونة الخلايا السرطانية الناجمة عن EMT. استنادا إلى بروتوكول41المنشأة ، تعاملنا مع EMT المستمدة Py2T مورين خلايا سرطان الثدي مع rosiglitazone المخدرات المضادة للسكري لمدة 10 أيام للحث على adipogenesis. تم تقييم Adipogenesis عن طريق تصور قطرات الدهون باستخدام النفط الأحمر O تلطيخ. تم الكشف عن الخلايا الدهنية بسهولة في rosiglitazone المعالجة Py2T مورين خلايا سرطان الثدي (الشكل 7) ، والتي أظهرت أن العلاج مع rosiglitazone وحدها كافية لتعزيز تغاير خلايا سرطان الثدي المستمدة من EMT إلى adipocytes. الشكل 1: TGF-β/SMAD الإشارات. TGF-β الإشارات يبدأ مع ربط TGF-β لمستقبلات TGF-β نوع II (TβRII), كيناز نشط التأسيسي, أن الفوسفور TGF-β نوع مستقبلات I (TβRI). ثم، تنشيط TβRI كيناز فوسفوريلات SMAD2/3. الببتيد الذي يحتوي على عزر SSXS من SMAD2 مع اثنين من مخلفات سيرين الفوسفورية الطرفية الكربوكوكسي تم استخدامه للحصول على مضادات الانسة متعددة النخلة التعرف على الفوسفور-SMAD2 (P-SMAD2). لذلك، يمكن استخدام تحليل التعبير p-SMAD2 بواسطة النشاف الغربي لتحديد تنشيط مسار إشارة TGF-β. يمكن أن يشكل SMAD2/3 الفوسفورية مجمعات غير ية مع SMAD4، والتي يتم تحويلها بعد ذلك إلى النواة لتعديل الاستجابات النسخية. CAGA12-luciferase مراسل مقايسة وكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) للتعبير عن مرنا من الجينات الهدف TGF-β مثل SMAD7 وSRPINE1 (ترميز PAI-1 البروتين)، يمكن استخدامها لتحليل الاستجابات النسخية التي β TGF-التي تسببها SMAD3- تعتمد على. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: بنية تخطيطية من R-SMADs (SMAD2 و SMAD3). يتم حفظ المجالات MH1 (الأزرق) و MH2 (أصفر) بين R-SMADs ولكن لا يتم حفظ منطقة الرابط (الرمادي). يضم المجال MH1 SMAD3 عزر ملزم للحمض النووي، بينما لا يمكن ربط SMAD2 الحمض النووي مباشرةً، بسبب الإدراج (exon 3) في مجاله MH1. يتوسط المجال MH2 oligomerization SMAD، والتفاعل مع مستقبلات β TGF، وملزمة للبروتين وتشارك في التنظيم النسخي. SMAD2 و SMAD3 يمكن تفعيلها بواسطة الفوسفور من عزر SSXS (باللون الأحمر) في الترميني C الخاصة بهم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: EMT الناجم عن β TGF. خلال β TGF الناجمة عن الظهارية – انتقال mesenchymal (EMT) ، تخضع الخلايا لفقدان الظهارية واكتساب الخصائص mesenchymal مع تعزيز حركة الخلية والقدرة على الغزو. تحريض EMT يؤدي إلى التعبير عن علامات mesenchymal مثل N-cadherin، Zeb2، وSdth1/2، فضلا عن downregulation من علامات الظهارة بما في ذلك E-cadherin، β-catenin، وكلاودين-1. يؤدي فقدان أو كسب المتراكمة من الخصائص الظهارية /mesenchymal (E/M) خلية إلى دخول الحالات المتوسطة بطريقة عكسية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: TGF-β إشارات الردود في خلايا MCF10A-رأس. (أ)تم معالجة خلايا MCF10A-Ras إما باستخدام أو بدون TGF-β (2.5 نانوغرام/مل) لمدة ساعة واحدة، وتم مناعة الخلايا لـ SMAD2 ذات الفوسفور (p-SMAD2) وSMAD2/3 و GAPDH (كتحكم في التحميل). يتم عرض علامة الحجم على اليمين. كون: مجموعة التحكم دون TGF-β العلاج. (B) تحليل TGF-β (5 نانوغرام / مل) النشاط باستخدام SMAD3 – SMAD4 – تعتمد CAGA12-luciferase (لوك) مراسل النسخ في MCF10A -راس الخلايا. يتم تطبيع القيم إلى β-galactosidase (βGal) النشاط. ويعبر عن البيانات على أنها متوسط ± s.d، n = 3. اختبار الطالب t، *** P ≤ 0.001(C)qRT-PCR تحليل الجينات الهدف TGF-β SMAD7 و SERPINE1 (ترميز بروتين PAI-1) في MCF10A-Ras الخلايا المعالجة ب TGF-β (2.5 ng/mL) لمدة 6 ساعات. وقد استخدمت جابد كضوابط داخلية. ويعبر عن البيانات على أنها متوسط ± s.d، n = 3. الطالب t اختبار، *** P ≤ 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: نظام EMT الناجم عن β TGF في خلايا NMuMG. (أ) مورفولوجيا خلايا NMuMG تعامل مع TGF-β (2.5 نانوغرام / مل) لمدة 1 أو 2 أيام. في وجود TGF-β، تفرّق خلايا NMuMG إلى نمط ظاهري مِينسي. شريط مقياس = 150 ميكرومتر(ب) تم التعامل مع خلايا NMuMG أو بدون TGF-β (5 نانوغرام / مل) لمدة 2 أيام، وتم تحليل علامات EMT بواسطة النشاف الغربية. علامة الحجم كما هو مبين على اليمين. كون: مجموعة التحكم دون TGF-β العلاج. (C) تحليل التعبير الجيني لعلامات EMT(CDH1 (ترميز بروتين E-cadherin)، SNAIL و ZEB2) في خلايا NMuMG المعالجة لمدة 2 أيام مع TGF-β (5 نانوغرام / مل). وقد استخدمت جابد كضوابط داخلية. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± s.d., n = 3. اختبار t للطالب، *P ≤ 0.05، **P ≤ 0.01، *** P ≤ 0.001. (D) كانت خلايا NMuMG ملطخة بالفلورس المناعية للكشف عن التعبير عن علامة الظهارة E-cadherin (الأحمر) بعد TGF-β (2.5 نانوغرام /مل) العلاج لمدة يومين. تم اخصاب النوى مع DAPI (الأزرق). تم التقاط الصور مع المجهر confocal. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (E) كانت تلطخت خلايا NMuMG مع الفلورسين-phalloidin (الأخضر) لتصور F-actin. تم اخصاب النوى مع DAPI (الأزرق). شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: TGF-βignaling وTGF-β الناجمة عن EMT تم تثبيطها من قبل SB431542 وGW788388. (أ)تم علاج خلايا NMuMG بـ 10 ميكرومتر من SB431542 (SB) أو التركيزات المشار إليها من GW788388 (GW) في وجود أو عدم وجود TGF-β (5 نانوغرام/مل) لمدة ساعة واحدة. تم lysates الخلايا مناعي P-SMAD2، SMAD2/3 و GAPDH. (ب) تم علاج خلايا NMuMG بـ 5 ميكرومتر من SB431542 (SB) أو 10 ميكرومتر من GW788388 (GW) في وجود أو غياب 5 نانوغرام /مل من TGF-β لمدة ساعة واحدة وملطخة بـ المناعة للكشف عن النقل النووي لـ SMAD2/3 (الأخضر). تم التقاط الصور مع المجهر confocal. (C) تم تحليل التعبير عن الجينات الهدف TGF-β، بما في ذلك PAI-1 والمورثات ترميز علامات EMT، بما في ذلك الحلزون، E-Cadherin وFeenectin، عن طريق عكس ردود الفعل البوليميراز (RT-PCR) في الخلايا NMuMG بعد العلاج SB أو GW والتحفيز TGF-β لمدة 48 ساعة. جابده بمثابة عنصر تحكم التحميل. يشير عنصر التحكم إلى الخلايا غير المعالجة. وقد تم تعديل هذا الرقم من بيترسن م وآخرون . 34 بإذن من الناشر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: يمكن أن يتم تحريض خلايا سرطان الثدي Py2T مورين المشتقة من EMT على التفريق إلى الخلايا الشحمية. تم تحفيز خلايا سرطان الثدي Py2T مورين مع 2 نانوغرام /مل TGF-β لمدة 20 يوما للحث على EMT كاملة. ثم، تم التعامل مع الخلايا إما مع DMSO كتحكم في السيارة أو rosiglitazone (2 μM) لمدة 10 أيام للسماح بتمايز خلايا سرطانية mesenchymal والحث على تكوين الخلايا الدهنية. تم تغيير الوسط كل يومين. بعد 10 أيام من العلاج، كانت تلطخت الخلايا باللون الأحمر الزيت O. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. جنس اسم جين إلى الأمام (5 ‘إلى 3’) عكس (5 ‘إلى 3’) بشري جابد TGCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG SMAD7 TCCAGATGCTGCCTTCC GTCCGAATTGCTCCG سيربين1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC فأر جابد TGGCAAAGAGAGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC غاغغاتغتاك تيغكاتغ حلزون CAGCTGGCCAGGCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA ZEB2 TTCTGCAAGCCTGTAGCC TTCTGCCCCATTGCATCATات الجدول 1: التابلُس المستخدم في نظام qRT-PCR.

Discussion

TGF-β/ SMAD الإشارات يلعب دورا محوريا في تطور سرطان الثدي, كما أنه يمكن تعزيز سرطان الثدي الخلايا الغازية و الانبثاث عن طريق تحفيز EMT7. هنا، وصفنا سير العمل المنطقي للتحقيق في الإشارات التي بدأتها TGF-β من تنشيط SMAD الناجم عن المستقبلات إلى الاستجابات النسخية والبيولوجية بوساطة SMAD. بدأنا من خلال وصف تحليل الفوسفور SMAD2، واصلت مع استجابات النسخ SMAD3 التي تسببها TGF-β والتعبير علامة EMT على حد سواء الجينات ومستويات البروتين لتحليل استجابة إشارة TGF-β/SMAD، وأخيرا فحصت EMT الناجمة عن β TGF. استخدمنا مراسل CAGA12-luciferase النسخ التي تحتوي على صناديق CAGA المستمدة من منظم PAI-1، لرصد نشاط TGF-β/SMAD إشارة مسار35. يتطلب إنشاء المراسل SMAD3 و SMAD4 للتنشيط. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الضربة القاضية من SMAD4 في تخفيف TGF-β الناجمة عن CAGA12-luciferase النشاط37. بالإضافة إلى مقايسة المراسل، فإن تحديد حالة الفسفور من SMADs الذاتية، بما في ذلك SMAD2 و SMAD3، هو طريقة أخرى للتحقيق في استجابة الإشارات β TGF. في الواقع، وأعضاء آخرين من عائلة TGF-β، مثل عامل النمو والتمايز (GDF)-8/myostatin وGDF-9، أيضا إشارات transduce عبر SMAD2/3 البروتينات عن طريق إشراك TβRI42،43،44. بالإضافة إلى مراسل CAGA12-luciferase ، تم استخدام العديد من المراسلين المماثلين للكشف عن تفعيل إشارات TGF-β. على سبيل المثال، يمكن أن يكون النسخ (SBE)4-Lux مراسل مع عناصر الاستجابة المستمدة من المروج JunB مستحثة بكفاءة من قبل TGF-β، activins وBMPs45.

وقد استخدمت النشاف الغربي وqPCR لتحليل EMT التي تسببها TGF-β، والتي هي أساليب كلاسيكية للتحقيق في التعبير عن علامات الظهارة (أي، E-cadherin) وعلامات mesenchymal (أي، N-cadherin، الحلزون، سبيكة وZeb2). كما قمنا بأداء لطخة المناعة غير المباشرة من e-cadherin وتلطيخ الفلوري المباشر من F-actin. هذه المقايسات التحقق من صحة النموذج الظاهري mesenchymal من الخلايا بعد العلاج TGF-β. إن الحد من تلطّخ الفلورات المناعية هو أن الخلايا تحتاج إلى إصلاح قبل الحضانة بالأجسام المضادة والتصوير، ومن الصعب التحقيق في التغيرات في تعبير علامة EMT في الخلايا الحية. في الآونة الأخيرة، تصميم خطوط الخلايا مراسل EMT، مثل A549 الرئة غديcarcinoma-vimentin-RFP، جعلت من الممكن رصد التحول من الخلايا الظهارية إلى خلايا mesenchymal في الوقت الحقيقي عن طريق التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) الموسومة فيمينتين. ويمكن استخدام هذه المنصة لفحص المخدرات وتطوير المخدرات الجديدة46. LifeAct صبغ, 17-الأمينية-حمض الببتيد, التي يمكن وصمة عار F-actin الهياكل في الخلايا الحية, أصبحت أداة قيمة لتصور cytoskeleton actin في الوقت الحقيقي دون التدخل في العمليات الخلوية47. في هذه الدراسة، استخدمنا اثنين من مثبطات جزيء صغير، SB431542 وWW788388، للتحقق من تأثيرها المثبط على إشارات TGF-β وEMT الناجمة عن β TGF. وتجدر الإشارة إلى أن GW788388 يمنع بقوة نشاط TβRI و TβRII، في حين أن SB431542 له تأثير مثبط على TβRI فقط (و ALK4 و ALK7). كشفت الدراسات السابقة أن GW788388 هو أكثر قوة في الجسم الحي من SB43154240. بالإضافة إلى تثبيط EMT ، GW788388 خفض التعبير عن علامات التليف في الكلى ، والإدارة عن طريق الفم من GW788388 في الفئران السكري انخفض بشكل ملحوظ glomerulopathy25،48.

EMT يلعب دورا أساسيا في تعزيز لدونية الخلايا السرطانية والنتائج في مقاومة المخدرات و الانبثاث 49. ولذلك، استهداف الخلايا المشتقة من EMT مع أدوية سمية للخلايا محددة50 أو تحفيز إعادة التمايز عن طريق انتقال الظهارية mesenchymal إلى الظهارية (MET)51 وقد اقترح كمقاربة للتغلب على الانبثاث الخلايا السرطانية ومقاومة العلاج. ومع ذلك، MET يساهم في انتشار الخلايا السرطانية المنشورة في الأجهزة البعيدة52، والتي قد تكون ذات نتائج عكسية عند استخدام الارتداد العلاجي ل EMT. في الآونة الأخيرة، أفادت دراسة جديدة نهج التفاضلية العلاجية من خلال استهداف الخلايا السرطانية الثدي المستمدة EMT مباشرة للتمايز إلى الخلايا الشحمية30. الدراسة التي أجراها إيشاي رونين وآخرون. al.30 تستخدم Py2T مورين الخلايا السرطانية الظهارية التي خضعت للانتقال إلى الخلايا المتوسطة استجابة للعلاج على المدى الطويل مع TGF-β. وقد أثبتوا أن rosiglitazone في تركيبة مع مثبطات MEK تعزيز التمايز الظهارية وdipdipogenesis. ومع ذلك، وجدنا أن rosiglitazone وحده كان كافيا للحث على الانتقال من خلايا الميرين الليسينشيمال Py2T إلى adipocytes.

وباختصار، فإن الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة وفرت سير عمل منطقي للتحقيق في إشارات β TGF و EMT الناجمة عن β. يمكن للمثبطين ، SB431542 و GW788388 ، منع الاستجابات الناجمة عن TGF -β و EMT. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أيضًا أن rosiglitazone وحدها تحفز تكوين الخلايا الدهنية في خلايا سرطان الثدي β الميسنشية التي تسببها TGF. على الرغم من أننا استخدمنا فقط عدة خطوط خلايا سرطان الثدي للتحقيق في الاستجابات TGF-β، يمكن استقراء الطرق الموصوفة هنا إلى خلايا (سرطان) أخرى. هنا، استخدمنا تركيزات TGF-β مختلفة للحث على الاستجابات الخلوية. في معظم أنواع الخلايا، TGF-β يمارس نشاطه البيولوجي في نطاق تركيز 0.01-10 نانوغرام/مل53 ويحفز الإشارات في نمط استجابة الجرعة. في الخلايا البطانية الأولية، بما في ذلك الخلايا البطانية الأبهري البقرية، تسبب TGF-β في التعبير الكبير من SMAD2 الفوسفوري عند 0.025 نانوغرام/مل، وصلت إلى حد أقصى عند 0.25 نانوغرام/مل، وظلت عند هذا المستوى استجابة لتركيزات أعلى53. في دراستنا، استخدمنا تركيز عال من TGF-β (5 نانوغرام/مل) في خلايا MCF10A-رأس لأقوال المراسل النسخي للحصول على ردود قوية. يمكن أن يكون السبب في ذلك الفسفور SMAD2 والتعبير الجيني الهدف بواسطة TGF-β بجرعة منخفضة; وهكذا، استخدمنا 2.5 نانوغرام/مل TGF-β لعلاج الخلايا. ومع ذلك، فإن التركيز الأكثر ملاءمة العمل يعتمد على نوع الخلية والآثار المقدرة. لتحديد أفضل تركيز من TGF-β, ينصح علاج الخلايا بجرعات مختلفة (من منخفضة إلى عالية).

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونعترف بدعم مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC) إلى J.Z. ومركز جينوميكس السرطان في هولندا (CGC). NL) إلى P.t.D.

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Ricerca sul cancro. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Ricerca sul cancro. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Ricerca sul cancro. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

TGF-betaEpithelial-to-mesenchymal Transition (EMT)Breast CancerNMuMG CellsE-cadherinF-actinCell MigrationCell InvasionMetastasisChemotherapy ResistanceIndirect Immunofluorescent StainingCell Density

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image