ヒト単球由来M1とM2の分極化と 結核 菌感染時のフローサイトメトリーによる解析

健康な匿名の献血者からのヒト末梢血は、スウェーデンのハディンゲにあるカロリンスカ大学病院の血液バンクから得られた(倫理的承認Dnr 2010/603-31/4)。生きた毒性Mtbを含むすべての実験ステップは、スウェーデン公衆衛生庁(FOHM)、ソルナ、スウェーデンのバイオセーフティレベル3(BSL-3)研究所で行われました。 1. 培地、バッファー、細菌培養物の調製 注: すべての試薬と消耗品の詳細は、 材料表に記載されています。 RPMI完全培地:1 mMのピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、および10%の加熱不活性化ウシ血清(FBS)を含むRPMI 1640を補う。Mtb感染を行う場合は、細胞培養培地中の抗生物質を避けてください。 無血清RPMI培地:1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミンおよび10 mM HEPESを含むRPMI 1640を補う。 洗浄バッファー: 0.05%(v/v) Tween-80 を含むリン酸緩衝塩(PBS)を準備します。 FACS バッファ: 2.5% (v/v) FBS と 0.5 mM EDTA を含む PBS を準備します。 固定バッファー: 4% ホルムアルデヒドを含む PBS を PBS に準備します。使用前に新しく調製し、例えば、37%ホルムアルデヒドのストック溶液から混合してください。 透過バッファー: 0.1% クエン酸ナトリウムと 0.1% トリトン X-100 を脱イオン水に加えます。 洗浄バッファー(免疫蛍光用):0.1%BSAおよび0.1%Tween-20を含むPBSを調製する。 ブロッキングバッファー: PBSに0.1%BSAおよび10%正常ヤギ血清(NGS)を含むPBSを調製します。 染色緩衝液(免疫蛍光のため):0.1%BSAを含むPBSをPBSに調製する。 結核完全培地:サプリメントミドルブルック7H9スープ0.05%(v/v)トゥイーン-80、0.5%(v/v)グリセロール、カナマイシン(20 μg/mL)、10%(v/v)ミドルブルックオレイン酸、アルブミン、デキストロースおよびカタラーゼ濃縮(ミドルブルックOADC濃縮)。 細菌培養:標準的な毒性のMtb検査株、H37Rvを使用して、緑色蛍光タンパク質(GFP)を構成的に発現し、単球由来細胞の感染を行う。このMtb株は、GFPをコードする遺伝子と、カナマイシン耐性の遺伝子を含むpFPV2プラスミドを運びます。抗生物質耐性により、カナマイシンを含む培養物中のプラスミド発現菌の連続的な選択が可能となる。細菌を-80°CでTB完全培地および70%グリセロール(1:1希釈)に保存する。 2. 末梢血単核細胞のバフィーコートからの分離 注:クラスIIバイオセーフティキャビネット内の人間の血液(潜在的に伝染性)ですべての作業を行います。廃棄する前に15分間消毒剤を含む残留血液製剤を不活性化する。この場合、健康なボランティアから血液が得られた。このインビトロマクロファージ分化プロトコルは、10 x 106 分離PBMCs/ドナー/ウェルを含むように設定されました。各ドナーから、1つのバフィーコートは、全血から発生する濃縮白血球懸濁液の約50mLを含み、通常は500〜800 x 106 PBMC を提供し、そこから約10%または50〜80 x 106 個の単球を回収することができます。 50 mLチューブで調製した密度勾配媒体の15 mLの上に15mLのバフィーコート血液をロードします。管の壁にピペット先端を傾け、密度勾配層の上にゆっくりと血液を重ね合わせ. 0加速と0減速で室温(RT)で25分間、600 x g でチューブを回転させます。注:遠心分離の前に慎重に蓋を閉じ、遠心分離後に潜在的なこぼれのためのチューブホルダーを常にチェックしてください。 滅菌パスツールピペットで上のプラズマ層を取り出し、その後、滅菌パスツールピペットを使用して、新しい50 mLチューブに単核細胞層を慎重に収集します。PBMCペレットに無血清RPMI培地を加え、50mLの最終容積を得る。RTで5分間500 x g で遠心分離する前にチューブを数回反転させることによって慎重に混合します。 上清を慎重に捨て、指の中でチューブの底を反転させて細胞ペレットを再中断します。 PBMCsから濃度勾配媒体汚染を除去するために、無血清RPMIで細胞を2~3回洗浄し、50mLの最終体積を得る。500 x g で 5 分間の遠心分離器 RT で 5 分間、細胞上清が透明になるまで洗浄します。 上清を捨て、細胞を20mLの無血清RPMI培地で再懸濁する。 トリパンブルー染色、手動で血球計を使用するか、または自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。セルの懸濁液を1:2または1:10希釈で希釈し、セルトリパンブルーサンプルを96ウェルプレート(例えば50μL+ 50 μL(血球計計用)または10μL+10μL(自動細胞数カウント用)に混合し、細胞を数えて生細胞/mLの数を得る。注意:トリパンブルーは有毒であり、別の化学廃棄物に廃棄する必要があります。 3. 単球由来細胞の分化と分極化 注:単球由来細胞の分化と分極化のために、M0、M1様、M2様細胞、および完全M1およびM2偏光細胞に対して以前に確立したプロトコルが25に続いた。ここでは、分かりやすくするため、完全偏光M1およびM2マクロファージのみを説明します。 単球の分離のためにプラスチック付着を使用してください。簡単に言えば、適切な濃度で6ウェル培養プレートに新たに分離したPBMCsを種分し、例えば、2mL無血清RPMI培地で10 x 106 PBMCs/well、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。 2~3時間後、非接着性細胞をピペットで取り除き、1mLの無血清培地でウェルを3回洗浄します。この付着した細胞は単球であり、ウェルに加えたPBMCs全体の約10%、すなわち10 x 10 6 PBMCsから10個 の10個 の単球を含む。 マクロファージ分化のために、M1およびM2マクロファージ分極のための50 ng/mL GM-CSFまたはM-CSFを含む働く溶液を準備し、ウェルあたりRPMI完全培地の2 mLで添加した。5%CO2インキュベーターで細胞を37°Cで3日間培養した。 3日目に、各ウェルの最上層から慎重に細胞培養培地1mLを除去し、M-CSFまたはGM-CSFの二重濃度を含む1mLの新鮮なRPMI完全培地で細胞培養液を補い、ウェル内の50ng/mL最終濃度を得る。100 ng/mL/well のあらかじめ作られた作業ソリューションに成長因子を追加します。 6日目に、細胞分化の最後の18〜20時間に対して異なる刺激を加え、完全に偏光および成熟したM1(インターフェロンγを得る。IFN-γ、及びリポ多糖;LPS(大腸菌O55:B5))またはM2(インターロイキン4;IL-4)マクロファージ。M1偏光の場合は、RPMI完全培地でIFN-γとLPSを調製し、ウェルあたり50 μLを加えて、細胞培養中の50 ng/mL IFN-γおよび10 ng/mL LPSの最終濃度を得ます。M2偏光の場合、RPMI完全培地でIL-4を調製し、ウェルあたり50 μLを加えて、細胞培養中の20ng/mLの最終濃度を得ます。 M0偏光マクロファージの分化については、M-CSFのみで細胞を刺激し、サイトカインを追加(M2様表現型を提供する)を一切加えずに25。 光顕微鏡で単球由来細胞培養の形態を定期的に確認し、より小さな単球が大きなマクロファージ様細胞に分化されるようにする。また、M1とM2偏光の間の潜在的な形態学的差異、すなわち、より丸みを帯びた形状25を有するM2細胞と比較して、細長いM1細胞および伸伸長M1細胞を監視する。 7日目に、単球由来細胞のプレートをBSL-3検査室に移し、有害なMtbを感染させる。 4. Mtb文化の作製 注: BSL-3 ファシリティでは、以下の手順を実行する必要があります。悪質なMtbを使用するすべての作業のために、保護服、呼吸保護、および耐エタノール性手袋を使用してください。 細菌アリコートの1 mLでバイアルを解凍し、50 mL濾過キャップチューブに9 mLの完全な培地(1:10希釈)と混合します。37°Cおよび5%CO2でインキュベーター中の懸濁液を培養する。 24時間後、細菌の懸濁液を2,300 x g で10分間回転させ、慎重に培地を注ぎます。新しい50 mLろ過キャップ培養チューブに15〜20 mLの新鮮な結核完全培地で細菌ペレットを再懸濁し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。2~3日ごとにチューブに沈降した細菌を混合して、すべての細菌細胞に均質な栄養補給を維持します。 7~10日後、50 mLスクリューキャップチューブに移す前に、上下にピペットを入れて適切に細菌懸濁液を混合します。 35~40 mLの無菌洗浄バッファーを50 mLチューブに加え、2,300 x g で10分間、細菌の懸濁液を回転させます。洗浄手順を一度繰り返します。細菌ペレットを1mLの無血清RPMI培地に再懸濁し、マイクロピペットでピペット化する。 さらに9 mLの無血清RPMI培地を加え、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で細菌懸濁液を37°Cで5分間超音波処理し、細菌の塊を破壊します。チューブを水浴超音波処理器に繰り返し(3~4回)浸して、細菌の塊の最大の破壊を確実にします。バイオセーフティキャビネット内に配置された分光光度計を使用して、1mLの細菌懸濁液の光学密度(OD)を600nm波長で測定します。無血清RPMI培地を使用して、基準を設定します。 (OD+0.155)/0.161 = Y, Y x 107= Y x 106 CFU/mL、例えば、OD値0.32は細菌濃度(0.32 +0.155)/0.161=2.95、2.95 x 10 7=29.5 x 106 CFU/mLを提供する。 5. 単球由来細胞のMtb感染 注: BSL-3 ファシリティでは、以下の手順を実行する必要があります。 無血清RPMI培地中の細菌ペレットを新しい無菌50 mLチューブに再懸濁し、最終細菌濃度を約5 x 106 CFU/mLに調整します。 単球由来細胞を含む6ウェルプレートから細胞培養培地を取り除く。各ウェルに無血清RPMI培地1mLを加えます。細菌懸濁液を1ウェルあたり1 mL添加して感染多重性(MOI)5:1、すなわち、2mL/wellで106マクロファージあたり5 x 106 CFUを得て、37°Cおよび5%CO2で4時間プレートをインキュベートする。 感染後、細胞外細菌を除去するために1mLの無菌洗浄バッファーで細胞を3回洗浄する。プレートを傾け、慎重にコーナーから全体の洗浄バッファーを削除します。抗生物質を使わずに2 mLのRPMI完全培地でMtb感染した単球由来細胞を再懸濁し、細胞をフローサイトメトリーの前にさらに24時間(または他の時点)のために細胞を流動させる。 6. Mtb感染単球由来細胞のフローサイトメトリー染色 注: BSL-3 ファシリティでは、以下の手順を実行する必要があります。フローサイトメトリー染色は、チューブの代わりに96ウェルプレートで行うことができます。 Mtb感染細胞(および未感染コントロール)を6ウェルプレートのウェルから取り外し、37°Cおよび5%CO2で少なくとも30分間、1ウェル当たり1mLのFACSバッファをインキュベーションします。 ピペットを数回上下に軽くして、細胞が切り離されていることを確認します。可能であれば、顕微鏡検査で細胞剥離を確認してください。各ウェルからセルサスペンションをねじ込みマイクロ遠心チューブに移し、200 x g で5分間チューブを回転させます。上清をピペットで慎重に捨てます。 各チューブ内の細胞ペレットをFACSバッファーで2回洗浄し、200 x g で細胞を5分間回転させます。 TLR2(AF647)、CD206(APC-Cy7)、CD163(BV605)、CD80(BV65)を含むフルオロクロム共役抗ヒト抗体の約50μLカクテルを有する細胞(約0.5 x 106〜10 6 個/チューブ)を染色する )、CCR7(BV711)、CD86(BV786)、CD200R(PE)、CD64(PE-ダズル594)、HLA-DR(PE-Cy5)(表1)を4°C(冷蔵庫)で30分間生用染料ゾンビ-UVと組み合わせて暗い。 400 μL の FACS バッファーで染色した細胞を 2 回洗浄し、200 x g で 5 分間回転させます。 暗い場所でRTで30分間、200μLの固定バッファー(新たに調製)で染色した細胞を固定し、マイコバクテリアの完全な不活性化を確実にします。 400 μLのFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、200 x g で 5 分間回転して余分な固定バッファーを除去します。 FACSバッファーの400 μLで固定細胞を再懸濁し、新しい1 mLマイクロ遠心分離チューブにサンプルを移してからBSL-2のフローサイトメトリーのためにBSL-3の実験室から取り出します。染色した細胞は、サンプル取得まで+4°Cで保存します。注:BSL-3の実験室からそれらを取り出す前に70%エタノールでチューブをスプレーしてください。ホルムアルデヒドは有毒(発がん性)であり、クラスIIバイオセーフティキャビネットで取り扱う必要があります。ホルムアルデヒド廃棄物を別の化学廃棄物に廃棄する。 7. Mtb感染単球由来細胞のフローサイトメトリックデータ取得および分析 注: 手順 7.1 ~ 7.2 は、前述のフロー サイトメトリー染色の前に実行する必要があります。細胞固定後のタンデム色素の凝集および解離の問題を回避するために、一次抗体染色後4〜10時間以内にMtb感染細胞と未感染細胞のサンプル取得が行われる。 上記のフローサイトメトリー染色の前に、補償ビーズ(陽性および陰性の両方)を用いて、染色パネルに記載されているフルオロクロム共役抗体(表1)ごとに蛍光シグナルを補正する。 ヒトマクロファージの染色に対する抗体希釈を活性化し、フルオロクロームごとに最適なシグナルを得る。 染色されていない細胞を使用して、陰性細胞集団のゲートを設定するために必要なバックグラウンド蛍光のレベルを決定し、染色された細胞を視覚化することができます(マクロファージは高度に自己蛍光です)。 データ収集に推奨されるソフトウェアを使用して、フローサイトメーターで最低50,000個のセル/サンプルを取得します。 フローサイトメトリー標準(FCS)形式3.1のフローサイトメーターから取得ファイルをエクスポートします。 フローサイトメトリー解析ソフトウェアのFCSファイルを解析します。 前方および側面散乱(FSCおよびSSC)特性に従ってマクロファージをゲートし、ゾンビ-UV生存率染料を使用して生細胞/死細胞ゲーティングによって死細胞を除外する。 FITCチャネルでH37Rv-GFP感染マクロファージを可視化します。 全マーカーに対して正に染色された細胞および幾何平均蛍光強度(MFI)の頻度を特定する(表1)。 8. Mtb感染単球由来細胞の蛍光染色 注:Mtb感染はBSL-3施設で行う必要があります。 免疫染色の場合、無血清RPMI培地の500 μLの種子2 x 105 PBMCs/ウェルを8ウェルチャンバースライドに入れ、2 x 104 の単球/ウェルを得る。単球の分化およびM1/M2分極化後、上述したようにMtb感染を進める。30分間の固定バッファでMtb感染の24時間後にスライドを固定します。固定スライドは、さらなる分析が行なくなるまで-20°Cの冷凍庫に保管されます。 200 μLのPBSで、単球由来の細胞をそれぞれ10分間2回洗浄します。 200 μL のパーメアビライゼーションバッファーで、RT で 5 分間透過します。 200 μLのPBSで細胞を3回洗浄し、それぞれ5分間洗浄します。 200 μLの洗浄バッファーをそれぞれ 5 分間洗浄して、細胞を 2 回洗います。 RTで30分間のブロッキングバッファの200 μLで非特異的な結合をブロックします。 一次抗体を染色バッファーで1:100希釈し、非コンジュゲートCD64抗体(クローン:10.1)でM1細胞をインキュベートし、M2細胞を非共役CD163抗体(ポリクローナル)で2時間RTで培養します。 次に、200 μLの洗浄バッファーをそれぞれ 10 分間洗浄して、細胞を 3 回洗浄します。 蛍光標識二次抗体を染色バッファーで1:1,000希釈し、抗マウスIgG-Alexa Fluor 594でM1細胞をインキュベートし、抗ウサギIgG-アレクサフルーオール594をRTで1時間培養します。 200 μLの洗浄バッファーで細胞を3回洗浄し、それぞれ 10 分間洗います。 チャンバーグリッドを取り外し、各ウェルにDAPI取り付け媒体の約20 μLを追加し、各スライドに1.5 mmのカバースリップを置きます。 マニキュアの層でカバースリップをシールします。 GFP(グリーンチャネル)の励起のために486 nmで放出されるレーザーを用いた共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、DAPI(青)の場合は402 nm、2次抗体(赤)の場合は560nmをそれぞれ取得します。