M1 和 M2 人类单细胞衍生细胞的极化和对 结核病 感染的流动细胞学分析

从瑞典胡丁格卡罗林斯卡大学医院的血库获得健康匿名献血者的人体外周血液（道德批准 Dnr 2010/603-31/4）。所有涉及活毒性Mtb的实验步骤都是在瑞典索尔纳公共卫生局生物安全3级实验室进行的。 1. 准备媒体、缓冲器和细菌培养物 注：有关所有试剂和耗材的详细信息均在 材料表中提供。 RPMI完整介质：补充RPMI 1640与1mM丙酸钠，2米L-谷氨酰胺，10米HEPES和10%热灭活胎儿牛血清（FBS）。在与 Mtb 感染合作时，避免在细胞培养介质中使用抗生素。 无血清RPMI介质：补充RPMI 1640与1mM丙酸钠，2米L-谷氨酰胺和10米血清。 洗涤缓冲区：准备含 0.05% （v/v） 补间-80 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。 FACS 缓冲区：准备包含 2.5% （v/v） FBS 和 0.5 mM EDTA 的 PBS。 固定缓冲：将含有 4% 甲醛的 PBS 制备到 PBS 中。确保在使用前新鲜准备，例如，从 37% 甲醛的库存溶液中混合。 渗透缓冲：加入0.1%的柠檬酸钠和0.1%的Triton X-100到除离子水。 洗涤缓冲（用于免疫荧光）：准备含有0.1%BSA和0.1%补间-20的PBS。 阻塞缓冲区：准备含有 0.1% BSA 和 10% 普通山羊血清 （NGS） 到 PBS 的 PBS。 染色缓冲（用于免疫荧光）：将含有 0.1% BSA 的 PBS 准备到 PBS。 TB 完整介质： 补充中布鲁克 7H9 汤与 0.05% （v/v） Tween-80， 0.5% （v/v） 甘油， 卡那霉素 （20μg/mL）， 10% （v/v） 米德尔布鲁克油酸， 白蛋白， 德克斯特罗斯和卡塔拉塞浓缩 （米德布鲁克 OADC 浓缩）. 细菌培养：使用标准的毒性Mtb实验室菌株H37Rv，构成绿色荧光蛋白（GFP），用于单细胞衍生细胞的感染。这种Mtb菌株携带一个pFPV2质粒，其中含有编码GFP的基因，以及一个耐卡那霉素的基因。抗生素耐药性使含有卡纳霉素的培养物中能够持续选择质粒表达细菌。将细菌储存在结核病完全中等和 70% 甘油 （1：1 稀释） 在 -80 °C。 2. 外周血单核细胞与浅色外衣分离 注意：在 II 类生物安全柜内用人体血液（可能具有传染性）执行所有工作。在丢弃前，用消毒剂灭活残留血制品15分钟。在这种情况下，血液是从健康的志愿者那里获得的。此体外宏噬菌体分化协议旨在包括 10 x 106 个孤立的 PBMC/捐赠者/井。从每个捐赠者，一个 buffy 外套包含约 50 mL 的浓缩白细胞悬浮来自全血， 它通常提供 500×800 x 106 PBMC，其中约 10% 或 50×80 x10 6 单核细胞可以检索。 在 50 mL 管中制备的密度梯度介质 15 mL 之上装载 15 mL 的浅层涂层血。通过将移液器尖端倾斜到管壁上，慢慢地将血液覆盖在密度梯度层的顶部。 在室温 （RT） 下以 600 x g 旋转管子 25 分钟，加速 0 和减速。注意：在离心前小心地关闭盖子，并始终检查管架在离心后是否可能溢出。 使用无菌巴斯德移液器取出顶部等离子层，然后使用无菌巴斯德移液器小心地将单核细胞层收集到新的 50 mL 管中。将无血清RPMI介质添加到PBMC颗粒中，以获得50mL的最终体积。在 RT 500 x g 离心前将管子倒置几次，小心混合 5 分钟。 小心丢弃超细剂，通过翻转手指内管底来补充细胞颗粒。 为了去除 PBMC 中的密度梯度中等污染，使用无血清 RPMI 清洗电池 2–3 次，以获得 50 mL 的最终体积。离心机在 500 x g 5 分钟在 Rt. 洗涤， 直到细胞超母体变得透明。 丢弃超母细胞，在20mL无血清RPMI介质中补充细胞。 通过尝试泛蓝色染色、手动使用血细胞仪或使用自动细胞计数器来计数细胞。通过将 96 井板（如 50 μL + 50 μL（用于血细胞计计数）或 10 μL = 10 μL（用于自动细胞计数）中的细胞-trypan 蓝色样本混合，稀释 1：2 或 1：10 中的锥形蓝色细胞悬浮，并计算细胞以获得活细胞/mL 的数量。注意：三潘蓝是有毒的，必须丢弃在单独的化学废物中。 3. 单核细胞衍生细胞的分化和偏振 注：为了区分和偏振单细胞衍生细胞，我们以前为M0、M1样和M2样细胞以及完全M1和M2极化细胞建立的协议遵循了25。简单来说，这里只描述了完全两极分化的M1和M2巨噬细胞。 使用塑料粘性隔离单核细胞。简言之，种子新鲜分离的PBMC在6井培养板在适当的浓度，例如，10 x10 6 PBMC/井在2 mL血清无RPMI介质和孵育在37°C和5%CO2。 2–3 h 后，用移液器取出非粘附细胞，用 1 mL 无血清介质清洗井 3 次。附着的细胞是单核细胞，约占添加到井中的 PBMC 总数的 10%，即从每口井添加的 10 x10 6 个 PBMC 中检索到的 10 6 个单核细胞。 对于宏噬菌体分化，准备一个工作解决方案，分别包含 50 ng/mL GM-CSF 或 M-CSF 用于 M1 和 M2 巨噬细胞极化，每口井添加 2 mL 的 RPMI 完整介质。在37°C的5%CO2 孵化器中培养细胞3天。 在第3天，小心地从每口井的顶层取出1mL的细胞培养介质，用含有M-CSF或GM-CSF双浓度的1mL新鲜RPMI完整介质补充细胞培养物，以获得50 ng/mL的最终浓度。在 100 ng/mL/井的预制工作解决方案中添加生长因子。 在第6天，添加不同的刺激，为最后18-20小时的细胞分化，以获得完全极化和成熟的M1（干扰素-γ：IFN-γ，和脂质糖;LPS（大肠杆菌O55：B5）或M2（间皮4：IL-4）巨噬细胞。对于 M1 偏振，在 RPMI 完整介质中准备 IFN-γ 和 LPS，每口井添加 50 μL，以获得细胞培养物中 50 ng/mL IFN-γ和 10 ng/mL LPS 的最终浓度。对于 M2 极化，在 RPMI 完整介质中准备 IL-4，每口井添加 50 μL，以获得细胞培养物中 20 ng/mL 的最终浓度。 对于M0极化巨噬细胞的分化，仅用M-CSF刺激细胞，无需任何额外的细胞因子（提供M2样表型）25。 用光显微镜定期检查单核细胞衍生细胞培养的形态，以确保较小的单核细胞分化成较大的巨噬细胞。此外，监测M1和M2两极分化之间的潜在形态差异，即拉长和拉伸的M1细胞与M2细胞相比，形状更圆的25。 在第7天，将带有单细胞衍生细胞的板转移到BSL-3实验室，以感染毒性Mtb。 4. Mtb 文化的准备 注意：以下步骤必须在 BSL-3 设施中执行。对于所有与毒性Mtb的工作，使用防护服，呼吸保护，和乙醇耐药手套。 用 1 mL 的细菌别名解冻小瓶，并在 50 mL 过滤帽管中与 9 mL 的 TB 完整介质（1：10 稀释）混合。将悬浮在37°C和5%CO2的孵化器中培养。 24 小时后，在 2，300 x g 下旋转细菌悬架 10 分钟，并小心地从介质上倒出。在新的 50 mL 过滤帽培养管中，用 15~20 mL 的新鲜 TB 完整介质补充细菌颗粒，并在 37 °C 和 5% CO2中孵育。每 2–3 天混合管中的定居细菌，以维持所有细菌细胞的均质营养供应。 7–10 天后，通过上下管道正确混合细菌悬架，然后转移到 50 mL 螺丝帽管中。 将 35×40 mL 的无菌洗涤缓冲器添加到 50 mL 管中，并在 2，300 x g 下旋转细菌悬架 10 分钟。重复洗涤步骤一次。通过用微皮管将细菌颗粒重新喷入 1 mL 的无血清 RPMI 介质中。 再加入 9 mL 的无血清 RPMI 介质，在 37 °C 时将 II 类生物安全柜内的细菌悬浮物加入 5 分钟，以破坏细菌团。将管子反复浸入水浴声波器中（3–4 次），以确保细菌团的最大破坏。使用放置在生物安全柜内的光谱仪测量 600 nm 波长下 1 mL 细菌悬架的光学密度 （OD）。使用无血清RPMI介质设置参考。 使用公式计算菌落形成单位 （CFU） 的数量：（OD=0.155）/0.161 = Y， 和 Y x 107= Y x 106 CFU/mL， 例如， OD 值 0.32 提供细菌浓度 （0.32 + 0.155）/0.161 = 2.95， 2.95 x 107= 29.5 x 106 CFU/mL. 5. 单细胞衍生细胞的Mtb感染 注意：以下步骤必须在 BSL-3 设施中执行。 将无血清RPMI介质中的细菌颗粒重新注入新的无菌50mL管中，并将最终细菌浓度调整至约5 x 106 CFU/mL。 从包含单核细胞衍生的细胞的 6 个井板中取出细胞培养介质。向每口井添加 1 mL 无血清RPMI介质。每口井添加 1 mL 的细菌悬浮液，以获得多种感染 （MOI） 5：1，即 5 x 106 CFU 每 106 大噬细胞在 2 mL/井中孵育板 4 小时在 37 °C 和 5% CO2。 感染后，用1mL的无菌洗涤缓冲器清洗细胞3次，去除细胞外细菌。倾斜盘子，小心地从角落中取出整个洗涤缓冲区。在没有抗生素的RPMI完整介质的2mL中补充受Mtb感染的单核细胞衍生细胞，然后在流式细胞测量前将细胞染色或孵育24小时（或其他时间点）。 6. 受Mtb感染的单核细胞衍生细胞的流动细胞测量染色 注意：以下步骤必须在 BSL-3 设施中执行。流动细胞测量染色可以在96井板而不是管中进行。 通过孵育每口井1mLS的FACS缓冲器，在37°C和5%CO2时，将受Mtb感染的细胞（和未受感染的控制）从6井板中的井中分离出至少30分钟。 轻轻上下吹笛几次，以确保细胞分离。如果可能，用显微镜确认细胞分离。将细胞悬架从每口井转移到螺丝封顶的微中心管中，并在 200 x g 下旋转管 5 分钟。通过管道小心地丢弃超自然。 用FACS缓冲器在每个管中清洗两次细胞颗粒，在200 x g 下旋转细胞5分钟。 用大约 50 μL 鸡尾酒（包括TLR2 （AF647）、CD206 （APC-Cy7）、CD163 （BV605）、 CD80 来染色细胞（约 0.5 x 10 6 x10 6细胞/管） （BV650）、CCR7（BV711）、CD86（BV786）、CD200R（PE）、CD64（PE-炫目594）、HLA-DR（PE-Cy5）（表1）与活性染料僵尸紫外线在黑暗中4°C（冰箱）结合30分钟。 用 400 μL 的 FACS 缓冲器清洗染色细胞两次，以 200 x g 旋转细胞 5 分钟。 在黑暗中的RT用200μL的固定缓冲（新鲜准备）修复染色细胞30分钟，以确保分枝杆菌完全失活。 用 400 μL 的 FACS 缓冲器清洗两次细胞，在 200 x g 下旋转 5 分钟，以去除多余的固定缓冲区。 将固定细胞在 400 μL 的 FACS 缓冲器中恢复，并将样品转移到新的 1 mL 微中微富格管中，然后从 BSL-3 实验室取出 BSL-2 的流动细胞测量。将染色细胞储存在 +4 °C 中，直到采集样品。注意：在将管子从BSL-3实验室取出之前，先用70%的乙醇喷洒管子。甲醛是有毒的（致癌的），必须在II类生物安全柜中处理。将甲醛废物丢弃在单独的化学废物中。 7. 对受Mtb感染的单核细胞衍生细胞进行流动细胞测量数据采集和分析 注意：步骤 7.1–7.2 应在上述流细胞测量染色之前执行。为避免细胞固定后细胞结块和串联染料分离问题，在原抗体染色后 4-10 小时内对 Mtb 感染细胞和未受感染的细胞进行采样。 在上面描述的流动细胞学染色之前，使用补偿珠（正负）补偿染色板（表1）中列出的每个荧光共生抗体的荧光信号。 滴定抗体稀释，以染色人类巨噬细胞，以获得每个氟色素的最佳信号。 使用未受污染的细胞来确定为负细胞群设置门所需的背景荧光水平，从而使染色细胞可视化（巨噬细胞是高度自动荧光）。 使用推荐的数据采集软件在流动细胞仪中获取至少 50，000 个单元/样本。 从流细胞计中导出流细胞仪中的采集文件，以流细胞测量标准 （FCS） 格式 3.1。 在流量细胞分析软件中分析 FCS 文件。 门巨噬细胞根据其前部和侧面散射（FSC和SSC）特性，使用僵尸-UV活性染料通过活细胞/死细胞门控排除死细胞。 在 FITC 通道中可视化 H37Rv-GFP 感染的巨噬细胞。 识别所有标记的正染色细胞的频率和几何平均荧光强度 （MFI）（表 1）。 8. 受Mtb感染的单细胞衍生细胞的免疫荧光染色 注：Mtb 感染必须在 BSL-3 设施中进行。 对于免疫染色，种子 2 x 105 PBMC/井在 500 μL 的无血清 RPMI 介质到 8 井室幻灯片获得 2 x 104 单核细胞/井。在单核细胞分化和M1/M2偏振后，继续进行上述Mtb感染。用固定缓冲区修复 Mtb 感染 24 小时后的幻灯片 30 分钟。固定幻灯片储存在-20°C的冰箱中，直到进一步分析。 用200μL的PBS清洗单细胞衍生细胞两次，每次10分钟。 在RT用200μL的渗透缓冲器渗透细胞5分钟。 用 200μL 的 PBS 清洗细胞 3 次，每次洗 5 分钟。 用 200μL 的洗涤缓冲器清洗两次，每次洗涤 5 分钟。 在RT上用200μL的阻塞缓冲区阻止非特定绑定30分钟。 在染色缓冲区中稀释主要抗体 1：100，用未受伤害的 CD64 抗体（克隆： 10.1）和 M2 细胞在 RT 使用未结合的 CD163 抗体（多克隆）孵育 M1 细胞 2 小时。 接下来，用200μL的洗涤缓冲器清洗细胞3次，每次洗10分钟。 在染色缓冲器中稀释标有二次抗体的荧光剂 1：1，000，并在 RT 上用防鼠器 IgG-Alexa 氟 594 和带防兔 IgG-Alexa 氟 594 的 M2 细胞孵育 M1 细胞 1 小时。 用 200 μL 洗涤缓冲器清洗细胞 3 次，每次洗涤 10 分钟。 拆下腔室网格，在每口井中加入约 20μL 的 DAPI 安装介质，并在每个滑梯上放置 1.5 毫米盖片。 用一层指甲油密封盖唇。 使用共焦显微镜获取图像，激光发射速度为 486 nm，用于激发 GFP（绿色通道）、402 nm 用于 DAPI（蓝色）和 560 nm 用于二次抗体（红色）。