이 프로토콜은 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 성인 마우스 반열혈구의 세그먼트의 과균 보조 미세 절부, 그리고 그 안에 있는 세포 모형, 그리고 스쿼시 제제 및 그대로 관 세그먼트의 후속 면역 염색을 설명합니다.
정자 발생은 궁극적으로 신체의 가장 뚜렷한 세포 유형 중 하나, 정자를 초래하는 독특한 분화 과정입니다. 세균 세포의 분화는 4~5세대의 세균 세포를 동시에 숙주하고 그들의 발달을 조정하고 동기화하는 체세포 세톨리 세포의 세포질 주머니에서 일어난다. 따라서, 단면 내의 세균 세포 유형의 조성은 일정하며, 이들 세포 협회는 반열상피 주기의 단계(I-XII)라고도 한다. 중요한 것은, 단계는 또한 과자 빛 흡수/산란 특성에 기초하여 온전한 반열구관으로부터 확인할 수 있고, 스테이지가 수치 순서로 관을 따라 서로 를 따라 다르다는 사실. 이 문서에서는 마우스 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 반열관 세그먼트의 분리를 위한 일시적인 보조 미세 절제 방법을 설명합니다. 반열구의 광 흡수 패턴은 먼저 해부 현미경으로 검사된 다음 특정 단계를 나타내는 튜블러 세그먼트를 절단하고 다운스트림 응용 제품에 사용됩니다. 여기서는 단계별 스쿼시 제제와 그대로 튜블러 세그먼트를 위한 면역스테인팅 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 연구원이 정자 발생의 특정 단계에서 일어나는 생물학 사건에 집중할 수 있게 해주며, 따라서 정자 발생 및 근본적인 분자 메커니즘의 발달, 독성 및 세포학 연구를 위한 독특한 도구를 제공합니다.
디플로이드 정자에서 성숙한 haploid spermatozoa, 즉,정자 발생에 이르기까지 남성 세균 세포의 분화는 성적으로 성숙한 개인의 고환에서 반열구의 상피에서 일어나는 복잡한 과정이다1. A1 정자의 미토틱 후손은 먼저 분화 최선을 다하고 인구를 확장하기 위해 다섯 번 분할한 다음, 궁극적으로 haploid 정자를 초래하는 정자 세포로 메이오시스를 입력합니다. 둥근 정자를 정자로 분화하여 정자, 즉정자 발생은 핵 다짐및 곡어및 기조와 같은 정자 특정 구조의 건설을 포함하여 세포 형태학의 복잡한 변화를 수반합니다. 마우스에서, 정자 발생의 전체 과정은2,3을완료하는 데 35 일이 걸립니다.
어떤 주어진 된 로케일에서, 반열성 상피는 발아 세포와 세균줄기/선조 세포 및 체세포 세르톨리 세포의 최대 5개의 코호트를호스트합니다. 발아 세포를 분화하는 것은 동심층을 형성하여 예측 가능한 조성물을 형성하고, 주어진 발달 단계에서 haploid 세포는 항상 특정 유형의 정자 세포 및 정자와 연관된다4,5. 따라서, 튜블의 모든 단면은 일정한 조성물의 세균 세포의 집단을 호스트한다. 이러한 특정 세포 협회는 반열성 상피의 단계로 정의된다. se 당 단계는 정체된 체크 포인트와 같은 상태를 제시하지 않지만 생식 세포 코호트의 분화가 동기화된 1,2,6에서진행됨에 따라 지속적으로 개발됩니다. 마우스에서는, 반열혈관의 세로축을 따라 세그먼트 방식으로 배열되는 12단계(I-XII)2가 있으며, 따라서 반열성 상피, 또는 정자성파7,8,9(도 1)의물결을 형성하는 논리적 순서로 서로를 따른다. 정자 발생의 완성은 4 주기를 소요하고, 어떤 반열성 관 단면 내의 분화 배아 세포의 계층적 층 또는 코호트는 서로 떨어져 일시적으로 하나의 반열성 주기입니다. 사이클의 길이는 종에 따라 다르며 마우스에서 각 주기마다 8.6 일이10일 소요된다.
단계는 조직학적 고환 섹션5(도 1 및 도 2)에대한 반열성 상피의 세포 조성 및 조직에 기초하여규명될 수 있다. 그러나, 조직학적 분석은 힘들고 시간이 많이 걸리며 고정 및 염색이 필요하며, 따라서 살아있는 조직에 적용할 수 없습니다. 중요한 것은, 또한 주기의 상이한 단계에 의해 전시된 뚜렷한 광 흡수/산란 패턴을 이용하여 해부 현미경하에서 살아있는 조직에 대해서도 수행될 수있다(도 2). 빛을 흡수하고 분산시키는 각 단계의 능력은 주어진 단계 호스트및 번들7,11에서이들 세포의 포장을 하는 후기 메이오틱 후 정자의 크로마틴 응축 수준에 상대적이다. 정자 분화, 즉,정자 발생은 둥근 정자(1-8단계) 및 정자(9-16단계) 분화(도1)의8단계 와 8단계를 포함하여 16개의 발달 단계로 더 나뉜다. 단계 9-11 긴 정자 (단계 IX-XI) 디스플레이 는 낮은 수준의 크로마틴 응축만 표시하여 낮은 양의 빛이 흡수됩니다. 크로마틴 응축은 11단계에서 시작되며(단계 XI), 및 15-16단계 긴 정자(단계 IV-VIII)는 완전히 응축된 크로마틴을 함유하고 있으며, 따라서 최대빛흡수(도 3)를나타낸다. 크로마틴은 정자 머리에 단단히 포장하기 위해 응축 될 필요가있다. 빛 흡수 패턴에 기여하는 추가 요인은 상피 (기저 대 apical) 내에서 정자를 길게하는 위치와 긴 정자의 번들 (단계 II-V단계에서 발음)11 (그림 3). 번들은 튜룰의 중간에 반점으로 볼 수 있으며 해부 현미경 아래 가장자리에 줄무늬로 볼 수 있으며 크로마틴을 더 응축할수록스팟/스트라이프(11)가어두워질수록 더 어두워질 수 있다.
이 문서에서는 반열성 상피 주기의 특정 단계를 나타내는 반열성 관 세그먼트의 분리를 위한 경유 방지 보조 미세 절제 방법의 사용을 설명합니다. 일단 단단된, 단계적 튜블러 세그먼트는 생화학 RNA 및 단백질 분석12,13,14,15,유동 세포측정16, 전 생체외관 배양(17) 및 면역스테인닝18을포함한 다양한 다운스트림 분석의 대상이 될 수 있다. 여기에서 우리는 또한 살아있는 세포 형태학 분석 및 후속 면역 염색을 위한 단계적인 tubule 세그먼트의 분쇄된 단층뿐만 아니라 tubule 세그먼트의 전체 마운트 면역 스테인링을 준비하는 상세한 다운스트림 프로토콜을 제공합니다. 그림 4에설명된 간단히 설명된 워크플로우입니다.
상기 측량 보조 마이크로절 방법은 단계의 동기화된 세포 조성덕분에 분화의 특정 단계에서 세균 세포의 정확한 식별 및 격리를 가능하게 한다. 중요 한 것은, 그것은 또한 살아있는 조직에 정자 발생 하는 동안 단계 의존 적 사건의 연구를 수 있습니다. 정자 발생에 대 한 확장 가능한 시험 관 모델의 부족을 감안할 때, 이 방법은 또한 단계 별 tubule 세그먼트 ex vivo에 표적 단기 개발 및 독성 연구를 허용의 독특한 장점이 있다12,17. 여기서 마우스에 대한 방법을 설명하는 동안, 쥐4,7,15,19,20과같은 반열상피 단계의 종과 세그먼트 배열을 가진 모든 포유류 종에 동일한 절차를 적용할 수 있다.
우리가 위에서 설명한 측량 보조 미세 절방법은 정자 발생의 연구를 위한 단계 지향적 접근을 가능하게 합니다. 정자 발생은 고도로 동기화된 과정이며, 정자 분화 중 모든 주요 단계는 분화 약정(단계VII-VIII), 메이오시스(VII-VIII), 메이오시스(VII-VIII), 메이오틱 분열(XII), 정자 연신(VIII) 및 정자(VIII)27,정자 의 개시와 같은 단계 의존적 방식으로 조절및 실행된다. 단계 지향 분석은 정자 발생의 특정 단계로 제한되고 그러므로 반열성 상피 주기의 정의된 단계에서만 발견되는 이러한 특정 사건을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 방법을 마스터하는 것은 몇 가지 연습과 좋은 품질의 해부 현미경과 적절한 조명 조건의 사용이 성공의 열쇠입니다. 일상적인 도구 키트의 일환으로이 방법을 구현하는 것은 크게 정자 발생 동안 분자 이벤트의 보다 정확한 해부를 허용하여 남성 생식 기능에 대한 연구의 영향과 생물학적 관련성을 향상시킬 수있는 능력을 갖는다.
우리가 연구한 모든 WT 마우스 균주는 유사한 과동 패턴을 표시하고 반열성 상피 주기의 단계에서 보존된 세포 협회를 전시합니다. 세균 세포의 정자 분화가 WT 마우스와 크게 다르지 않다는 조건하에, 우리가 연구한 모든 녹아웃 마우스 모델에도 동일하게 적용됩니다. 더욱이, 반열상피주기7의단계의 세로적 세그먼트 배열을 나타내는 다른 종에 적용될 수 있다. 그러나 비세그먼트 단계(예: 인간)를 사용하는 종은 사용할 수 없습니다. 일시적인 패턴을 정의하는 정자를 길게 하는 크로마틴 응축의 필수적인 역할을 감안할 때, 이 과정의 잘못된 규제는 필연적으로 이 방법의 구현에 영향을 미칠 것이 분명합니다. 청소년 마우스와 젊은 성인 (5-6 주)에서 과기 모양패턴은 아직 완전히 확립되지 않았으며, 따라서 8 주 이상 쥐만 사용해야합니다. 또한 반열성 상피 내에서 세포 아키텍처를 왜곡하기 때문에 튜블러를 압박하고 당기는 것이 불가피하게 일시적인 패턴에 영향을 미칠 것이라는 점을 명심하는 것이 중요합니다.
고립 된 반열관 세그먼트는 또한 meiosis를 포함하여 정자 발생 결합 프로세스의 ex vivo 관측 그리고 조작을 가능하게 하는 배양될 수 있습니다. 조직의 생존가능성을 보장하고 RNA 및 단백질 분해를 방지하기 위해 마우스를 희생한 후 2시간 이상 샘플을 수집하고 처리해야 합니다. 반열구의 전 생체 문화의 경우 희생에서 문화의 발병까지의 시간이 1 시간을 초과해서는 안됩니다. 튜블러 조각의 무결성은 일반적으로 제대로 수확하는 경우 시험관에서 최대 72 시간까지 유지 될 수 있습니다.
반열상피 주기의 단계는 스쿼시제제(16)의위상 대비 현미경을 사용하여 더욱 정확하게 정의할 수 있다. 현미경 검사는 분석에 추가 차원을 제공하고 정자발생28,29,30의특정 단계에서 세포 또는 세포 운동의 관찰을 허용하는 살아있는 세포에서 수행됩니다. 위상-콘트라스트 현미경 검사는 후속 면역 스테인링을 위한 정확한 스테이징을 제공하며, 이는 단계별 변화를 포함하여 정자 발생 시 단백질 발현 및 국소화 역학에 대한 매우 상세한 분석을 가능하게 합니다.
세포는 스쿼시 제제의 상피 문맥에서 방출되는 반면, 튜블러 세그먼트의 전체 마운트 면역 스테인링은 생리 환경에서 정자 세포 연구를 가능하게합니다. 따라서, 전산 제제는 횡단면에 면역스테인링보다 반열성 관 건축 및 세포간 접촉의 더 나은 시각화를 제공할 수 있다. 중요한 것은, 면역 스테인닝 전에 튜룰 세그먼트의 transillumination 지원 스테이징은 주어진 세그먼트의 특정 단계에 대한 정보를 포함시킴으로써 접근 방식을 더욱 강력하게 만듭니다. 전산 염색은 주변 골수 세포, 관류 대식세포 및 정자와 같은 반열구 관의 주변에서 세포를 연구하는 데 특히 유용한 도구이지만, 또한 메이오틱 및 후meiotic 세균 세포에 대한 연구에 대한 새로운 통찰력을 열 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 핀란드 아카데미 [315948, 314387에서 N.K.]의 보조금에 의해 지원되었다; 시그리드 주셀리우스 재단 [N.K., J.T.]; 에밀 알토넨 재단 [J.-A.M., T.L.]; 분자 의학투르쿠 박사 프로그램 [S.C.-M., O.O.].
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |