Análise de repertório imune do receptor de células T e B usando sequenciamento de última geração
Summary
O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.
Abstract
A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.
Introduction
O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente com a co-estimulação adequada, leva à ativação celular, resultando em secreção de citocinas, expansão clonal e geração de anticorpos, no caso de células B.
A enorme matriz das diferentes células T ou B é coletivamente denominada repertório imunológico, permitindo o reconhecimento de incontáveis epítopos diferentes. A fim de gerar um repertório tão vasto, ocorre um complexo processo de montagem aleatória de diferentes segmentos genéticos, criando combinações quase infinitas de receptores que podem ligar antígenos únicos1. Esse processo, chamado de recombinação V(D)J, inclui rearranjos de diferentes genes variáveis (V), diversidade (D) e junção (J), acompanhados de supressões aleatórias e inserções de nucleotídeos nas junções2.
A arquitetura do sistema imunológico adaptativo tem interessado cientistas em diferentes campos por muitas décadas. No passado, o sequenciamento de Sanger, a especificação da região 3 (CDR3) complementar e a citometria de fluxo foram utilizados para caracterizar o repertório imunológico, mas proporcionavam baixa resolução. Na última década, os avanços nos métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram uma visão aprofundada das características e composição dos repertórios TCR e BCR de um indivíduo3,4. Esses sistemas de alta produtividade (HTS) sequenciam e processam milhões de produtos TCR ou BCR reorganizados simultaneamente e permitem uma análise de alta resolução de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido. A NGS fornece uma nova estratégia para estudar o repertório imunológico tanto na saúde quanto na doença. Estudos utilizando HTS demonstraram repertórios alterados de TCR e BCR em doenças autoimunes5, imunodeficiências primárias6,7e malignidades, como na leucemia mielóide aguda8. Utilizando NGS, nós e outros mostramos expansão oligoclonal de clones específicos de células T e B, em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn9,10,11,12,13,14. No geral, estudos de diferentes campos sugerem que mudanças no repertório têm um papel crucial na patogênese de distúrbios imunomu mediados.
O protocolo atual descreve um método de isolamento do DNA de biópsias intestinais e sangue, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para NGS, e desempenho de sequenciamento executado. Também fornecemos passos básicos na análise de dados do repertório imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a geração de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. O método também é compatível com outros órgãos (por exemplo, linfonodos, tumores, fluido sinovial, tecido adiposo, etc.) desde que sejam utilizados protocolos de digestão específicos do tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nenhum.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
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