次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析
Summary
現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。
Abstract
免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。
ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。
Introduction
Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。
異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原1に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。
適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っています。以前は、サンガーシーケンシング、相補決定領域3(CDR3)スペクトルタイピング、およびフローサイトメトリーを使用して免疫レパートリーを特徴付け、低分解能を提供した。過去10年間で、次世代シーケンシング(NGS)法の進歩により、個人のTCRおよびBCRレパートリー3,4の特性と組成に関する詳細な洞察が可能になった。これらのハイスループットシステム(HTS)配列と処理は、同時に並べ替えられたTCRまたはBCR製品の数百万を、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞の高解像度分析を可能にします。NGSは、健康と病気の両方の免疫レパートリーを研究するための新しい戦略を提供します。HTSを利用した研究は、自己免疫疾患におけるTCRおよびBCRレパートリーの改変を実証した5、原発性免疫不全6、7、および急性骨髄性白血病における悪性腫瘍8などである。NGSを用いて、我々および他の人々は、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、潰瘍性大腸炎およびクローン病9、10、11、12、13、14のオリゴクローナル拡張を示している。全体として、異なる分野からの研究は、レパートリーの変化が免疫媒介性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。
現在のプロトコルは、腸内生検および血液からのDNAの分離、NGS用のTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、およびシーケンシング実行の性能を記述する。免疫レパートリーデータ解析の基本ステップも提供しています。このプロトコルは、TCRα、TCRγ、およびIGLライブラリの生成にも適用できます。この方法は、組織特異的な消化プロトコルが使用されている限り、他の器官(例えば、リンパ節、腫瘍、滑液、脂肪組織など)と互換性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍18において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ)10、19、および種々の免疫不全17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
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