Preparación de nanopartículas para análisis ToF-SIMS y XPS

Este artículo presenta una variedad de métodos de preparación de muestras para el análisis de superficies de nanopartículas. Dado que las propiedades fisicoquímicas de un NP específico definirán tanto el método óptimo para la preparación de la muestra (por ejemplo, fundición por gota frente al recubrimiento por espín) como el mejor procedimiento para ese método (por ejemplo, que requiera diferentes sustratos o disolventes), la idoneidad del método utilizado debe validarse a través de métodos analíticos alternativos y optimizarse si es necesario. Los resultados observados en esta publicación son consistentes con la literatura publicada anteriormente al mostrar la necesidad de protocolos y procedimientos consistentes para la preparación de muestras, así como la necesidad de controles de calidad para garantizar que los métodos de preparación y purificación de muestras sean apropiados, exitosos y no dañen las nanopartículas22,33,34,35,36. Los métodos de muestreo y almacenamiento para los NP no se han abordado aquí, ya que se describen en detalle en varias otras referencias14,15,16,17,18,34,37,38,39. Naturalmente, se debe tener mucho cuidado de que las muestras analizadas sean representativas de la distribución general de nanopartículas y se desarrollen y validen métodos de muestreo adecuados. También se ha demostrado que las condiciones de almacenamiento afectan fuertemente las propiedades de las nanopartículas durante un período de meses y, por lo tanto, deben considerarse cuidadosamente. Como ejemplo, recomendamos que las nanopartículas se almacenen en pequeñas cantidades en recipientes sellados lejos de la luz, idealmente por debajo de 4 ° C. También es crucial que el almacenamiento, el muestreo y la preparación de muestras se realicen de manera consistente de acuerdo con procedimientos validados, así como que se documenten en detalle. Esta documentación debe incluir los metadatos de los propios NP, como la información de procedencia y las condiciones de almacenamiento40. Herramientas como los cuadernos de laboratorio electrónicos (ELN) pueden ser útiles para la documentación coherente de procedimientos y metadatos NP, así como para permitir la producción de datos de acuerdo con el principio FAIR (Findable, Accessible, Interoperable y Reusable). El análisis preciso y correcto de la superficie de los NP requiere, en primer lugar, una elección adecuada del sustrato. Hemos utilizado obleas de Si limpias como sustratos porque están fácilmente disponibles, son duraderas, fáciles de limpiar, conductoras y suficientemente planas, sin embargo, dependiendo de los objetivos del análisis, la capa superficial de óxido puede ser un inconveniente, ya que los hidrocarburos adventicios en el sustrato no se pueden diferenciar de los de las nanopartículas. Cuando sea necesario, se pueden utilizar otros materiales como recubrimientos de oro o poliméricos en obleas de Si, obleas de Si3N4 o HOPG (grafito pirolítico altamente orientado)19,20,21,22. El primer paso en la preparación de la muestra descrito en este documento es la limpieza de la oblea de Si, que se muestra como un esquema en la Figura 1. La eficacia del proceso de limpieza se puede verificar mediante una variedad de métodos, incluido XPS, como se muestra en la Figura 2. El principal contaminante (carbono adventicio) es típico de las muestras almacenadas en el aire y se reduce significativamente después del proceso de limpieza. Además, la hidroxilación de la superficie de la oblea a través del tratamiento UV u ozono evita el efecto de anillo de café de la deposición de la suspensión acuosa al mejorar la humectabilidad y conducir, por lo tanto, a una distribución más homogénea de las nanopartículas como se muestra en la Figura 3. Se pueden utilizar métodos alternativos de limpieza química húmeda para las obleas de Si según sea necesario; aquí solo se requiere una superficie reproduciblemente limpia en lugar de la eliminación completa de todos los contaminantes orgánicos o la capa de óxido. Si el protocolo se detiene entre los pasos de limpieza y deposición de suspensión, la oblea debe tratarse nuevamente bajo plasma o UV / ozono y la suspensión debe depositarse idealmente dentro de los 15 minutos posteriores al tratamiento. La suspensión de nanopartículas de núcleo Au-Ag de 60 nm que se muestra en la sección 2.2 contenía una cantidad significativa de citrato de sodio como estabilizador, que es una ocurrencia común en las suspensiones de nanopartículas. Para un análisis preciso de estas partículas y sus propiedades superficiales, particularmente a través de XPS, se debe eliminar la mayor cantidad posible de estabilizador, ya que atenúa la señal de las nanopartículas y causa efectos de carga. Con el fin de establecer el método de purificación óptimo para estas nanopartículas, mostradas como micrografías SEM en la Figura 4, se dializaron en agua ultrapura o se purificaron mediante centrifugación y reexpersión por triplicado. Aunque la diálisis parecería un método más suave y la centrifugación y la reexspersión tienen más probabilidades de causar aglomeración y agregación de las partículas, las imágenes SEM muestran una deformación y daño significativos de las nanopartículas de Au-Ag después de la diálisis (Figura 4B), mientras que las partículas centrifugadas / redespersadas aún están intactas (Figura 4C ). Esto es particularmente notable con nanopartículas metálicas; nuestra hipótesis es que hay una cantidad óptima de citrato de sodio que permite cierta estabilización de la solución sin interferir con la señal de las nanopartículas, y la eliminación de demasiado estabilizador causa daño a las nanopartículas. Un informe anterior muestra que existe un número óptimo de ciclos de centrifugación para la eliminación de la mayor parte del citrato de sodio; exceder este número causa cierta agregación de NP33. En este estudio, se requirieron nueve ciclos de diálisis (un total de 36 h) para obtener una concentración de citrato similar; sin embargo, este método resultó en una mayor cantidad de agregación que la centrifugación, además de causar una disminución en la funcionalización de la superficie. Estos resultados demuestran la importancia de verificar cada paso en el procedimiento de preparación para cada tipo diferente de nanopartícula, particularmente con muestras desconocidas. Las nanopartículas de núcleo-cáscara Au-Ag de 60 nm utilizadas en este ejemplo son adecuadas para la fundición en gota debido a su conductividad eléctrica, porque los efectos de carga no son un problema y se puede generar un punto grueso mediante la deposición repetida utilizando relativamente poco equipo. Esta capa más gruesa tiene la ventaja de dar mediciones más reproducibles, y la fundición a partir de una suspensión más concentrada puede ahorrar tiempo al reducir el número de pasos de deposición. La deposición puede estar influenciada por la humectabilidad del sustrato; una mala humectación puede producir una mancha de nanopartículas gruesas que es ventajosa para muestras conductoras, mientras que una buena humectación puede producir una capa de nanopartículas más homogénea, que puede ser útil tanto para muestras conductoras como aislantes. Como se describe en el protocolo, la fundición por gota de suspensiones de nanopartículas generalmente requiere aplicaciones repetidas para obtener una capa gruesa con cobertura completa; esto debe verificarse utilizando XPS, pero también puede verificarse rápida y fácilmente mediante microscopía óptica. La Figura 5 muestra la evolución de la cobertura de gotas en una fundición de gotas de nanopartículas de núcleo-cáscara de Au-Ag a partir de solución acuosa; en este caso, se requieren 13 pasos de drop-casting para lograr una cobertura completa. La fundición por gota es particularmente adecuada para partículas conductoras, o aquellas en las que los efectos de carga pueden compensarse adecuadamente. Al igual que con los otros métodos descritos en esta publicación, la fundición por gota debe optimizarse para cada muestra, ya que los diferentes materiales NP tendrán diferentes propiedades con respecto a la profundidad de la información y la concentración y los límites de espesor de la película. Es importante evitar películas demasiado gruesas que pueden causar el apilamiento de compuestos orgánicos que a su vez inhiben la señal NP. Un recubrimiento homogéneo y de buena calidad ayuda a garantizar resultados consistentes y reproducibles. Además de los parámetros de concentración de suspensión, disolvente y recubrimiento de espín, la calidad de las suspensiones recubiertas de espín también puede verse influenciada negativamente por la presencia de polvo u otras partículas macro o microscópicas grandes. La Figura 6 muestra la mejora en la calidad del recubrimiento por espín de una suspensión de nanopartículas después de la filtración con un filtro de jeringa de 0,45 μm. El filtro debe seleccionarse para asegurarse de que no elimina las nanopartículas de la suspensión. Las tres concentraciones de suspensión diferentes descritas en el protocolo (90, 9,0 y 0,9 mg/ml de nanopartículas de núcleo-cáscara PS-PTFE de 135 nm) se fundieron en las mismas condiciones y se analizaron utilizando SEM y XPS. La imagen superior y el espectro en la Figura 7 muestran la película fundida de la suspensión de 90 mg / ml, que muestra una cobertura multicapa gruesa y sin brechas en la imagen SEM, así como una notable ausencia de picos de Si en los espectros CPS, lo que indica que no hay contribución del sustrato al espectro. Esta muestra es ideal para el análisis XPS o ToF-SIMS; además, los picos F1 más pequeños de la cáscara de las partículas se pueden ver claramente en ausencia de una gran señal del sustrato. La segunda muestra fundida de la suspensión de 9,0 mg/ml muestra las partículas en pequeños aglomerados de una sola capa, que no cubren completamente la superficie. Esta muestra es demasiado delgada y poco homogénea para el análisis XPS o ToF-SIMS. Además, el análisis cuantitativo puede verse afectado debido a la contribución de carbono adventicio en el sustrato, incluso después de una limpieza cuidadosa; como mínimo, tal efecto debe considerarse en el presupuesto de incertidumbre de la medición. Sin embargo, esta muestra sería ideal para el análisis SEM o TEM de la distribución del tamaño de partícula utilizando un software de análisis de imágenes, ya que las partículas existen en una sola capa y en un número suficiente (dentro de la imagen) para proporcionar una evaluación estadísticamente significativa. La muestra fundida a partir de la concentración más baja (0,9 mg/ml) no proporciona una cobertura continua ni una densidad de partículas suficiente para que sea adecuada para el análisis de la química de la superficie o la distribución del tamaño de las partículas. Un análisis cuantitativo fiable no es en absoluto posible debido a la influencia dominante del sustrato. Los NP de núcleo Al2O3-TiO2 con una capa externa de PDMS o glicerol se prepararon mediante fundición a gota de suspensión y de polvo utilizando el método “stick-and-go” para comparar los efectos de los diferentes métodos de preparación en la capa externa sensible. Las muestras fueron analizadas con ToF-SIMS, donde en los espectros se analizó mediante Análisis de Componentes Principales (PCA). PcA es una técnica estadística para reducir la dimensionalidad de grandes conjuntos de datos mediante la creación de nuevas variables no correlacionadas (los componentes principales), que maximizan la varianza en los datos41,42,43,44,45. La separación de diferentes conjuntos de muestras en el gráfico de componentes principales permite que los resultados se analicen y agrupen más fácilmente. En el gráfico de puntuaciones de PCA en la Figura 8B, que muestra el poder de discriminación de cada conjunto de datos en comparación con todos los demás conjuntos de datos (es decir, entre diferentes conjuntos de muestras), las dos muestras preparadas a partir de polvo muestran puntuaciones muy diferentes, mientras que las muestras preparadas a partir de dispersión muestran puntuaciones muy similares. Los gráficos de carga que se muestran en la Figura 8C indican la relación entre las variables, es decir, qué picos contribuyen más a los respectivos componentes principales. Todos los componentes principales se ordenan de acuerdo con su contribución a la diferencia observada entre los conjuntos de datos, es decir, PCA1 es el que más contribuye a la separación observada de los diferentes conjuntos de datos. Pc1 está dominado por la presencia (NP recubiertos de PDMS preparados a partir de polvo) o ausencia (todas las demás muestras) de picos de PDMS, mientras que PC2, el factor que representa la segunda mayor variación dentro de los conjuntos de datos, permite la diferenciación del Al2O3 y el taponamiento orgánico en los NP. Esto indica que los espectros medidos de los NP preparados a partir de la suspensión son muy similares y sugiere que las capas de PDMS y glicerol pueden haber sido eliminadas o dañadas por la preparación de la suspensión, ya sea de la propia suspensión o del proceso de secado, con señales dominantes del Al2O3 o TiO2. Si bien los gránulos prensados pueden proporcionar ventajas para la preparación de muestras en polvo, como la facilidad de manejo y la estabilidad en instrumentos de ultra alto vacío (incluida la capacidad de pulverizar sin desalojar np en la cámara de alto vacío), las altas fuerzas involucradas también pueden dañar nanopartículas sensibles, como ya se ha visto con otros métodos de preparación. Se debe preparar y validar un protocolo adecuado. En el caso de las dispersiones de NP, la criofijación de las suspensiones de muestra fundidas en gota evita los efectos del anillo de café (debido a la fijación instantánea de la suspensión de NP y, por lo tanto, la eliminación de los efectos de secado), así como la preservación de estructuras más grandes presentes en la suspensión. Además, se evita la aplicación de cinta adhesiva. Esto a su vez se refleja en señales reducidas, que pueden atribuirse a sales, contaminantes u otros artefactos del procedimiento de preparación de muestras en los respectivos espectros de masas como se muestra en la Figura 9. La principal ventaja de la criofijación es la capacidad de conservar “tal cual” el espacio químico alrededor de las nanopartículas y / o la entidad química de los aglomerados o heteroaglerados de partículas, así como su correlación con las características biológicas dentro de los tejidos o células individuales o incluso la colocalización a los compartimentos intracelulares, sin interrupción de los pasos de manejo de muestras como el secado, drop-casting, etc46’47. Hemos demostrado la aplicabilidad de la técnica de criofijación dentro del artículo actual y hemos destacado las ventajas de la criofijación para nanopartículas de TiO2. Destacamos que la criofijación es particularmente adecuada para el análisis de muestras biológicas debidas a su estado natural sin la dislocación de productos químicos debido a artefactos de preparación de muestras. Para obtener información más detallada sobre las técnicas de fijación de muestras biológicas, se remite al lector a la literatura19,25,27,48,49. XPS ToF-SIMS Haz de sonda Fotones Iones Haz de análisis Electrones Iones Resolución espacial* > 1 μm 0,1 μm Profundidad de muestreo 0,5 – 7,5 nm <2 nm Límite de detección 0,01 -0,1 átomo % Ppb Cuantificación Excelente (semi cuantitativo) Desafiante (efectos de matriz) Contenido de la información ElementalEnlace químico ElementalMolecular Análisis Orgánico Excelente Excelente en modo estático * especificado por el fabricante Tabla 1: Comparación de varios métodos para el análisis de superficies. Método Adecuado para Da Ventajas Desventajas Cautela Mandos Comprobar Diálisis Purificación Eliminación de estabilizadores/impurezas Equipo simple, de bajo esfuerzo, sin complicaciones Falta de control sobre el proceso Puede causar daño a las nanopartículas Hora Daño a las nanopartículas (SEM) Centrifugación/reexspersión Purificación Eliminación de estabilizadores/impurezas Más control sobre el proceso, concentración simultánea Intensivo en mano de obra, requiere centrifugación Puede causar agregación o aglomeración Velocidad de rotación de la centrífuga, cantidad de disolvente Aglomeración/ agregación/ daño a nanopartículas (SEM) Drop casting (suspensión) NP conductoras sin capa externa sensible Mancha recubierta relativamente gruesa Equipo simple, sin complicaciones Puede dar espesor no homogéneo, tiempo intensivo La preparación de la suspensión puede dañar las carcasas NP sensibles Concentración de suspensión, disolvente (humectabilidad del sustrato) Cobertura (microscopía de luz/XPS) recubrimiento de centrifugado (suspensión) NP conductores o no conductores sin capa externa sensible Capa homogénea delgada o partículas individuales Configuración coherente Requiere determinación experimental de parámetros óptimos Filtre el polvo / impurezas, la cobertura puede ser inconsistente Concentración, parámetros de recubrimiento de espín, disolvente Prefiltración, cobertura, espesor de capa (SEM/XPS) “stick and go” (polvo) NPS conductores y no conductores inorgánicos con capa externa sensible Mancha de polvo en el adhesivo Equipo simple, de bajo esfuerzo, sin complicaciones No apto para NP orgánicos o que contienen C, espesor de película inconsistente Peligro de liberación de NP en instrumentos Fijación de NP en adhesivo Estabilidad en condiciones de alto vacío deposición en el orificio de un talón (polvo) Análisis XPS; partículas orgánicas o inorgánicas conductoras/no conductoras Muestra de nanopartículas ligeramente prensada Sin contacto con otros materiales No hay fijación segura de NP; inadecuado para ToF-SIMS Dager de la liberación de NP en instrumentos Ninguno Incline ligeramente hacia un lado, para garantizar que el polvo se compacte Pellets prensados (polvo) NPS conductores y no conductores, NP poliméricos Pellet sólido Permite el análisis de NP poliméricos en polvo Puede dañar o contaminar la superficie del NP Los materiales deben limpiarse a fondo para evitar la contaminación de la superficie; puede dañar la superficie Tamaño, presión, tiempo Estabilidad en condiciones de alto vacío Criofijación (suspensión) Suspensiones NP con capa de ligando sensible; muestras biológicas Muestra sólida Conserva la morfología, el estado biológico nativo y la corona, reduce el efecto del anillo de café La preparación sofisticada y costosa y el manejo de muestras, requieren un usuario experto alto grado de habilidades requeridas para el manejo y almacenamiento de muestras Concentración, tamaño de las gotas, temperatura Conservación de la vitrificación Tabla 2: Comparación de diferentes métodos de preparación de muestras. Figura 1: Proceso de limpieza de obleas de Si. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Espectros XP de la oblea de Si antes y después de la limpieza. Encuesta antes (gris) y después de la limpieza (rojo), mostrando la disminución de la cantidad de carbono del 13 al% al 2 al%. Los espectros se obtuvieron con un Kratos Supra DLD (Manchester, Reino Unido) con una radiación Monocromática Al Kα. Las muestras se fijaron con cinta adhesiva doble en el soporte de la muestra, la energía de paso fue de 80 eV, el ancho de paso 1 eV, el tiempo de permanencia 500 ms. Se utilizó el “modo de lente híbrida”. El tamaño del punto de rayos X fue de 300 x 700 μm². Se utilizó una pistola de inundación para la compensación de cargos. Para el análisis cuantitativo, se utilizó el paquete de software UNIFit 202050 , utilizando las áreas pico de los picos fotoelectrones correspondientes corregidos con un fondo de Tougaard y normalizados con factores de Scofield, vías libres medias inelásticas y la función de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Efecto de la limpieza UV/Ozono sobre la homogeneidad de la dispersión de partículas en la fundición por gota de nanopartículas de PTFE-PMMA de núcleo-cáscara de suspensión acuosa. Las obleas limpias con UV/ozono muestran una disminución significativa en los anillos de café, así como una mejor adhesión de las partículas a la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Opciones de tratamiento para eliminar las impurezas (por ejemplo, estabilizadores) de las suspensiones de nanopartículas Imágenes SEM que muestran el efecto de la diálisis (arriba a la derecha) y la centrifugación y reexspersión por triplicado (abajo a la derecha) en nanopartículas de núcleo-cáscara Au-Ag de 60 nm. Las nanopartículas están claramente dañadas por la diálisis, mientras que la centrifugación no tiene ningún efecto visible. Todas las barras de escala son de 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Imágenes de microscopio óptico de nanopartículas de núcleo-cáscara Au-Ag de 60 nm de diámetro desde suspensión acuosa sobre obleas de silicio, mostrando una cobertura suficiente después de 13 gotas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Suspensión de nanopartículas recubiertas de espín, antes (izquierda) y después (derecha) de filtración con un filtro de jeringa de 0,45 μm. La mejora en la calidad después de la filtración se puede ver claramente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Imágenes SEM y espectros XPS de nanopartículas núcleo-capa de PMMA-PTFE fundidas a varias concentraciones, mostrando el efecto de los picos de sustrato (por cobertura insuficiente) en los espectros XPS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Gráfico de puntuación del análisis de componentes principales (PCA), derivado de los espectros ToF-SIMS de los NP de núcleo-shell Al2O3-TiO2 recubiertos de glicerol y PDMS. (A) Esquema de la estructura NP; (B) Puntuaciones y (C) Gráficos de carga después del análisis ToF-SIMS de los métodos de preparación drop-cast (dispersión) y “stick-and go” (polvo). PC1 representa picos que se correlacionan con fragmentos de PDMS; PC2 separa las muestras con un recubrimiento orgánico (muestras preparadas a partir de polvo) de picos de Al2O3 aparentemente sin recubrimiento superficial. Los espectros se midieron en modo positivo en un instrumento IONTOF ToF-SIMS IV (ION-TOF GmbH, Münster, Alemania) en el modo de espectrometría (HCBU) con un haz de iones Bi3+ de 25 kV con una densidad de dosis máxima de 1012 iones/cm2. Se escaneó un campo de visión de 150 x 150 μm en modo diente de sierra con 125 x 125 píxeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9: Sección de espectros de masas ToF-SIMS de NP de TiO2 . (A) preparado a partir de polvo con el método “stick and go” y (B) después de la criofijación de la dispersión NP. Un instrumento ToF-SIMS (ION-TOF V; Ion-TOF GmbH, Münster, Alemania) se utilizó para análisis de espectrometría de masas con una pistola de iones de metal líquido pulsada de 30 keV Bi3+ (LMIG, corriente continua (dc), 16 nA). Cada espectro se adquirió escaneando el haz de iones sobre un área de muestra de 500 × 500 μm. Se adquirieron iones secundarios positivos en el rango de masa 0-1,200 Da utilizando 106 pulsos Bi3+ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.