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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
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Divulgazioni
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Materials
Riferimenti
Immunologia e infezioni

Injeção intravitreal e quantitação de parâmetros de infecção em um modelo de rato de endophtalmite bacteriana

Published: February 06, 2021
doi:
10.3791/61749
, , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology,Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine,University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Descrevemos aqui um método de injeção intravitaliana e subsequente quantitação bacteriana no modelo de camundongos de endophthalmite bacteriana. Este protocolo pode ser estendido para medir as respostas imunes do hospedeiro e a expressão genética bacteriana e hospedeira.

Abstract

Infecções bacterianas intraoculares são um perigo para a visão. Pesquisadores usam modelos animais para investigar os fatores hospedeiros e bacterianos e vias de resposta imune associadas à infecção para identificar alvos terapêuticos viáveis e testar drogas para prevenir a cegueira. A técnica de injeção intravitreal é usada para injetar organismos, drogas ou outras substâncias diretamente na cavidade vítrea no segmento posterior do olho. Aqui, demonstramos essa técnica de injeção para iniciar a infecção no olho do rato e a técnica de quantificar bactérias intraoculares. Bacillus cereus foi cultivado em mídia líquida de infusão cardíaca cerebral por 18 horas e resuspended a uma concentração de 100 unidades formadoras de colônias (UFC)/0,5 μL. Um rato C57BL/6J foi anestesiado usando uma combinação de cetamina e xilazina. Usando um microinjetor picoliter e agulhas capilares de vidro, 0,5 μL da suspensão bacilo foi injetado no vitreous médio do olho do rato. O olho de controle contralateral foi injetado com mídia estéril (controle cirúrgico) ou não foi injetado (controle absoluto). Às 10 horas após a infecção, os camundongos foram eutanizados, e os olhos foram colhidos usando pinças cirúrgicas estéreis e colocadas em um tubo contendo 400 μL estéreis PBS e 1 mm de vidro estéril. Para os ensaios ELISAs ou mieloperoxidase, o inibidor de proteinase foi adicionado aos tubos. Para extração de RNA, foi adicionado o tampão de lise apropriado. Os olhos foram homogeneizados em um homogeneizador de tecido por 1-2 minutos. Os homogeneizadores foram diluídos em 10 vezes em PBS e faixa diluída em placas de ágar. O restante dos homogeneizadores foi armazenado a -80 °C para ensaios adicionais. As placas foram incubadas por 24 horas e a UFC por olho foi quantificada. Essas técnicas resultam em infecções reprodutíveis nos olhos do camundongo e facilitam a quantitação de bactérias viáveis, a resposta imune hospedeira e a omics da expressão genética hospedeira e bacteriana.

Introduction

A endophtalmite bacteriana é uma infecção devastadora que causa inflamação e, se não tratada corretamente, pode resultar em perda de visão ou cegueira. Endophtalmite resulta da entrada de bactérias no interior do olho1,2,3,4,5. Uma vez no olho, as bactérias se replicam, produzem toxinas e outros fatores nocivos, e podem causar danos irreversíveis a delicadas células e tecidos da retina. Danos oculares também podem ser causados por inflamação, devido à ativação de vias inflamatórias que levam ao influxo de células inflamatórias no interior do olho1,5,6. A endophtalmite pode ocorrer após cirurgia intraocular (pós-operatório), lesão penetrante no olho (pós-traumática), ou de propagação metastática de bactérias no olho de um sítio anatômico diferente (endógeno)7,8,9,10. Os tratamentos para endophtalmite bacteriana incluem antibióticos, anti-inflamatórios ou intervenção cirúrgica3,4,11. Mesmo com esses tratamentos, a visão ou o próprio olho podem ser perdidos. O prognóstico visual após a endophthalmitis bacteriana geralmente varia dependendo da eficácia do tratamento, da acuidade visual na apresentação e da virulência do organismo infectante.

Bacillus cereus (B. cereus)é um dos principais patógenos bacterianos que causa endophthalmite pós-traumática7,12. A maioria dos casos de endophthalmitis de B. cereus tem um curso rápido, que pode resultar em cegueira dentro de alguns dias. As marcas de Endophthalmitis B. cereus incluem inflamação intraocular em rápida evolução, dor ocular, perda rápida de acuidade visual e febre. B. cereus cresce rapidamente no olho em comparação com outras bactérias que comumente causam infecções oculares2,4,12 e possui muitos fatores de virulência. Portanto, a janela para intervenção terapêutica bem sucedida é relativamente curta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Os tratamentos para esta infecção geralmente são bem sucedidos no tratamento da endophthalmitis causada por outros patógenos menos virulentos, mas b. cereus endophthalmitis geralmente resulta em mais de 70% dos pacientes que sofrem de perda significativa da visão. Cerca de 50% desses pacientes são submetidos à evisceração ou enucleação do olho infectado7,16,22,23. A natureza destrutiva e rápida da endophthalmitis de B. cereus exige tratamento imediato e adequado. Avanços recentes no discernimento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de doenças identificaram potenciais metas de intervenção19,26,27. Modelos experimentais de camundongos de Endophthalmitis B. cereus continuam a ser úteis para discernir os mecanismos de infecção e testar potenciais terapêuticas que possam prevenir a perda de visão.

A infecção intraocular experimental de camundongos com B. cereus tem sido um modelo instrumental para a compreensão de fatores bacterianos e hospedeiros, bem como suas interações, durante a endophthalmite28. Este modelo imita um evento pós-traumático ou pós-operatório, no qual bactérias são introduzidas no olho durante uma lesão. Este modelo é altamente reprodutível e tem sido útil para testar terapias experimentais e fornecer dados para melhorias no padrão de atenção1,6,19,29,30. Como muitos outros modelos de infecção, este modelo permite o controle independente de muitos parâmetros de infecção e permite um exame eficiente e reprodutível dos desfechos de infecção. Estudos em modelo semelhante em coelhos nas últimas décadas examinaram os efeitos dos fatores de virulência de B. cereus no olho2,4,13,14,31. Ao injetar cepas mutantes B. cereus sem fatores individuais ou múltiplos de virulência, a contribuição desses fatores de virulência para a gravidade da doença pode ser medida por desfechos como a concentração de bactérias em diferentes horas de pós-infecção ou a perda da função visual13,14,27,31,32. Além disso, fatores hospedeiros foram examinados neste modelo infectando cepas de camundongos nocauteados sem fatores de hospedeiro inflamatórios específicos26,29,33,34,35. O modelo também é útil para testar tratamentos potenciais para esta doença injetando novos compostos no olho após a infecção30,36. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado que inclui infectar um olho de rato com B. cereus,colher o olho após infecção, quantificar a carga bacteriana intraocular e preservar espécimes para avaliar parâmetros adicionais de gravidade da doença.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e De Visão. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (números do protocolo 15-103, 18-043 e 18-087). 1. Agulhas de vidro estéreis Ligue o…

Representative Results

Gerar um inóculo reprodutível e precisão do procedimento de injeção intravitreal são passos fundamentais no desenvolvimento de modelos de endophthalmite microbiana. Aqui, demonstramos o procedimento de injeção intravitreal usando Bacillus cereusGram-positivo . Injetamos 100 UFC/0,5 μL de B. cereus no meio do vitreous de cinco camundongos C57BL6. Após 10h de pós-infecção, observou-se crescimento intraocular de B. cereus para aproximadamente 1,8 x 105 UFC/olho. <strong cla…

Discussion

Mesmo com a disponibilidade de antibióticos potentes, anti-inflamatórios e cirurgia de vitrectomia, a endophtalmite bacteriana pode cegar um paciente. Estudos clínicos têm sido úteis no estudo da endophthalmite; no entanto, modelos experimentais de endophthalmitis proporcionam resultados rápidos e reprodutíveis que podem ser traduzidos para o progresso no padrão de cuidado, resultando em melhor resultado visual para os pacientes.

O volume vítreo do olho do rato é de aproximadamente 7…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Dr. Feng Li e Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por sua ajuda. Nossa pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde bolsas R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 e R01EY024140. Nossa pesquisa também foi apoiada pelo P30EY21725 (bolsa NIH CORE para Imagem e Análise De Animais Vivos, Biologia Molecular e Imagem Celular). Nossa pesquisa também foi apoiada pelo programa de pré-doutorado NEI Vision Science 5T32EY023202, uma bolsa de apoio à pesquisa da Fundação Presbiteriana de Saúde e uma bolsa irrestrita ao Instituto Desaprocurado A. McGee Eye de Pesquisa para Prevenir a Cegueira.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA
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Riferimenti

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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).
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