原子力显微镜与红外光谱相结合，作为探测单一细菌化学的工具

所有有关致病菌的工作，都应采取适当的安全措施。这些措施包括在具有足够生物安全水平的实验室和生物安全舱（PC2）中工作，以及用适当的消毒剂（例如 80% 乙醇溶液）小心地净化工作区域。必须一直佩戴适当的 PPE。 1. 制备溶剂和材料 溶剂：使用超纯水作为溶剂。使用纯净水，在实验前自动清除，以避免任何潜在的交叉污染。 基板：使用这些基板中的任何一个用于AFM-IR，例如，ZnSe，CaF2，BaF2等。由于AFM-IR原则上是一种无损技术，人们可以将各种其他研究工具应用于AFM-IR分析后的同一样本。例如，如果使用拉曼级 CaF 2 或BaF 2幻灯片，可以执行结果与拉曼光谱学的相关性。 使用玻璃瓶代替塑料管，因为塑料会污染样品。 2. 自动对焦场的样品准备 样品的生长/孵化 在液体介质或固体板上生长细菌。根据所调查细菌物种的具体要求，选择介质、生长条件（例如温度、氧气供应）和生长时间的类型。例如，对于 S. Aureus 心脏输液 （HI） 丙酸酯板，在有氧条件下生长 16 小时，在 37 °C 下生长。注：为了达到最佳效果，生长/孵化应产生足够的细菌，以便收集微颗粒样品。菌落形成单位或细菌细胞的具体数量取决于细菌的类型和大小。 示例沉积 使用无菌循环，小心地从阿加板上的菌落中收集细菌，并将其转移到玻璃管中。只从殖民地顶部收集细菌。如果使用移液器从液体培养体收集样品，则将大约 1 毫升的细菌悬浮液转移到玻璃管中。体积可以根据细菌负荷进行修改。注：重要的是尽量不要从殖民地下面收集（或尽可能减少收集）任何媒介。后续的样品准备步骤旨在消除任何潜在的媒体残留物。从一开始就最大限度地减少潜在的中等残留物，从而能够从纯化细菌细胞中获取数据。步骤 2.2.2 和 2.2.3 适用于从 Agar 板中制备的样品。对于从液体介质中制备的样品，移动到步骤 2.2.4。 在管子中加入 1 mL 的超纯水。漩涡，直到收集的细菌颗粒不再可见在管子的底部（通常1-2分钟）。 通过将预制解决方案与麦克法兰标准之间的视觉比较30来估计使用的解决方案的粗糙浊度，例如麦克法兰标准。如果细菌悬浮物的浊度似乎非常低，则再次使用无菌循环和漩涡从板中加入更多细菌。重复上述步骤，直到解决方案的粗糙浊度与麦克法兰标准 0.5 和 1 相媲美。这通常会产生大量的细菌颗粒。 将细菌悬浮在 3，000 x g 下离心 5 分钟，以获得颗粒。注：离心参数可以修改，以获得细菌颗粒。如果增加 g 力，应谨慎行事，不要诱发细菌的破坏（特别是在革兰阴性细菌的情况下）。 使用移液器，轻轻地从颗粒上方取出超纳特。在管子和漩涡中加入 1 mL 的超纯水，以重新悬浮颗粒。随后，像第 2.2.4 步一样对样品进行离心机。 重复洗涤过程（步骤 2.2.2 和 2.2.4）至少三次。如果从液体介质中收集初始样品，则至少重复四次程序（介质去除后再进行三次洗涤）。 最后洗涤后，取出超高超，加入超纯水和漩涡至少2分钟。随后，将样品的 5 μL 沉积在基板上（例如拉曼级 CaF2）。 如果样品所需的厚度是多层细菌，则让样品晾干。 如果所需的厚度为单层或单个细菌，在沉积样品（步骤 2.2.7）后立即加入 20 至 100 μL 的超纯水，并轻轻地与移液器尖端混合。留给空气干燥。注：水的确切体积可能因实验而异，因为它取决于许多因素（例如，生物体的大小、颗粒的密度等），因此，最好从经验上确定。准备一系列添加不同量超纯水的样品，使人们能够选择具有所需细菌厚度/密度的样品。在随后的阶段，细菌的厚度/密度可以通过AFM轻松可视化。单层和单细胞样本的AFM图像示例显示在 图1A-H中。 使用双面胶带将基板安装在 AFM 金属标本盘上。 3. 仪器准备 注：此处描述的工具程序用于 材料表中列出的工具。如果使用 AFM-IR 仪器的新模型，详细工具程序可能与此处描述的程序略有不同。 按下 初始化 按钮，打开并初始化仪器。确保激光快门处于激光测试的 开放 位置。 如果设置了清除系统，则通过打开 N2 的流量清除 N2仪器。调整氮净化，以达到稳定的湿度水平（例如，20%）。确保湿度在测量期间以及背景和样本数据收集之间不波动。建议允许大约 20 分钟的湿度水平稳定。 按下负 载 按钮将样品加载到样品室中。样品加载是通过软件向导进行的。操作软件向导时，首先关注尖端，使用箭头在 Z 方向移动显微镜阶段并单击 Next。其次，调整数据收集点，使用箭头引导机内运动，并使用自动对冲M头顶上的旋钮对齐自动对焦激光和自动对焦传感器。随后，通过在 Z 方向移动显微镜阶段来聚焦样品表面。注：软件手册31提供了样品加载每个步骤的详细插图。应谨慎地对样本进行重点调查。当以 Z 方向接近样品表面时，使用慢速电机速度。 通过单击 “方法” 按钮即可接近示例，而无需参与。 4. 数据收集 背景 在数据获取之前，收集背景。对于背景收集，确保激光快门处于 打开 位置。选择光谱范围和分辨率（取决于分析目的）以及扫描次数和背景共同平均数。这些通常被推荐为高（例如，1024 次扫描和 3 次共同平均）。注：一般来说，建议光谱分辨率为 4 厘米-1或 8 厘米-1，光谱范围为 3，200 厘米-12，800 厘米-1和 1，800 厘米-1900 厘米-1。 获取后台保存背景文件。文件不会自动存储。将激光快门位置更改为 关闭。 样品 – 单光谱按 “参与” 按钮以进行示例。系统将开始接近样品表面，直到检测到直接接触。注：此工作中使用的设定点范围介于 0.15/2 V 之间，反馈增益（I Gain 和 P 增益）通常设置为 3 和 10。NIR2 接触探头常用纳米IR2 系统（型号：PR-EX-nIR2-10，共振频率 （kHz）：13 +/+4 kHz，弹簧常数（N/m）：0.07×0.4 Nm-1）。 收集自动对焦图像以可视化表面。首先，扫描空间分辨率较低的较大区域（例如 50 x 50 μm）（例如 200 x 200 点）（图 1I）。注：AFM-IR 数据始终以接触模式收集，但是，AFM 数据可以在接触或攻丝模式下收集。 从自动对焦高度/偏转图像中，选择特定的兴趣区域，并以更高的空间分辨率重新映像（图 1J+K）。确保数据收集速度适当，提示移动缓慢（例如，扫描速率 0.2 0.4 Hz）。 选择测量点（例如单一细菌），并将尖端移到该点。 对齐红外激光器。为此，请使用样本吸收的波数。对于生物材料，这可能是，例如，在一（1655厘米-1）。确保 带通过滤器 关闭，并单击 启动红外。纳米IR仪表中的右图（以振幅与频率显示的偏转的 FFT）应至少显示一个清晰的峰值，左图（偏转与时间）应具有周期性波形。如果情况并非如此，则继续优化红外点。注：即使快速四变换 （FFT） 和偏转显示预期配置文件，也建议对红外点进行至少几个波数的优化，其中波段是预期的。 使用选定的波数值优化红外数据收集的热点。使用细菌的传统红外光谱（例如细菌颗粒的 ATR 频谱）来识别菌带的位置并使用它们优化热点是有帮助的。从不同的光谱区域选择不同的波数值（例如 8/10）。注：如果在AFM-IR数据收集之前无法收集感兴趣的传统红外细菌谱，文献中可用的细菌光谱可以用作粗略指导。优化红外点的结果是图像，该图像在每个 x 和 y 位置显示 FFT 震级信号的地图。具有最大信号的位置会自动选择。软件手册31提供了此类图像的示例。 在优化选定波数值的红外点后，定义光谱数据收集的参数：光谱区域、光谱分辨率、扫描次数和应用功率，并将这些参数输入软件中的相应窗口。光谱分辨率应与背景分辨率相匹配，光谱区域应位于收集背景的光谱区域内。注：一般初始参数集可能是：光谱范围：3200厘米-12800厘米-1 和1800厘米-1-900厘米-1，光谱分辨率：4厘米-1 或8厘米-1，扫描次数：512 2048。 如果需要，根据信号调整激光功率。一般来说，激光功率的 8%到 10% 之间的值应该足以满足良好的信号质量。较高的值可以谨慎使用，因为它们可能导致样品损坏。注意：激光功率百分比可能因红外激光的类型而异。此处给出的百分比值用于 OPO 激光。 点击 获取 收集AFM-IR频谱。 收集AFM-IR频谱后，从同一区域重新收集AFM数据。这强烈推荐，因为它将揭示任何潜在的漂移和/或破坏性影响样品。 如果AFM-IR频谱令人满意，并且没有观察到对样本的破坏性影响，则继续收集数据。如果需要，使用 Array 选项定义一系列数据收集点，并收集 AFM 高度或偏转图像。此选项允许从每个点连续收集光谱，其光谱参数与单个频谱定义的光谱参数相同。 如果收集AFM-IR频谱后收集的AFM图像显示对样品（通常是燃烧点）的破坏性影响，则降低功率：选择不同的位置并重复步骤 4.3.8 至 4.3.11。 如果 AFM-红外频谱中的信号不尽如人意，请检查红外点优化的正确性（步骤 4.3.6）。如果正确，则稍微增加激光功率并重复步骤 4.3.7e 4.3.11。在实现满意的信号之前，可以重复此情况。 样品和成像方法注：强烈建议在收集选定波数值的强度分布图像之前记录细菌的单个AFM-IR光谱。 记录所选样本区域的 AFM 图像。为此，首先收集空间分辨率较低的较大区域的 AFM 图像（例如，50 x 50 μm，200 x 200 点），然后选择感兴趣的区域，并收集空间分辨率增加的 AFM 图像（ 如图 1I×K所示）。 选择 AFM-IR 成像的波数值。 确保激光的红外点针对选定的波数值（步骤 4.3.6）进行优化。如果某些波数（没有明确的最大值）未优化红外点，则针对它们进行优化。 定义图像区域的参数：宽度和高度、X 方向和 Y 方向的数据点数。注：如果应用了以前AFM图像中连续选择的斑点（如 图1-I-K所示），宽度和高度字段将在标记区域后自动填满。 定义光谱信号采集的参数：波长、扫描次数和激光功率。注：扫描次数需要保持在合理范围内。64 或 32 次扫描通常允许足够的信号量。 通过单击 扫描速率来定义 AFM 尖端运动的参数。前一步的扫描次数和 X 方向的数据点数越高，提示移动所需的速度就越慢。这些参数之间缺乏调整将导致尖端移动过快，从而阻止从每个点实际获取定义的扫描次数。注：例如，对于具有 64 个共同添加点和 200 点的红外信号的适当集合，将扫描速率设置为 0.07 kHz。 确保 启用红外成像 盒被勾选。 开始成像。所选波数信号强度的 AFM-IR 将与来自该区域的 AFM 数据同时收集。注：使用 OPO 激光时，可以同时收集接触谐振峰值频率图像。这可用于获取有关不同位置样品相对刚度的信息。 使用 捕获序列 窗口设置来自相同区域的连续收集的 AFM-IR 数据，这些数据具有相同的参数，但用于不同的波数值。为此，打开 捕获序列 窗口，键入每个波数，并定义应用激光功率（针对每个波数）。 将收集的数据（AFM 和 AFM-IR、单光谱和成像）导出到各种格式中，并使用适合特定研究目的的方法进行分析。