보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활^1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여^{3, 4,5를}생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리^6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)^{8,9,10,11,12,13,14, 14,16, 16, 16, 16, 16을}포함하여 메이오틱 정자 세포를 분리하는 몇 가지 다른^접근법이확립되었습니다. 그러나 이러한 방법에는 기술적 한계가 있습니다. 침전계 분리는 다수의^{세포를5,6,7을}산출하지만, 노동집약적이다. 설립된 FACS 기반 방법은 Hoechst 33342(Ho342)를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란 특성에 따라 메이오틱 정자세포를 분리하고 자외선(UV) 레이저^8,9,10,11을갖춘 FACS 세포 선별기가 필요합니다. 대체 FACS 기반 방법은 생동성 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 라인, 정자^{발생(12)의}동기화, 또는 살아있는^{세포(13)의}분리와 호환되지 않는 세포 고정 및 항체 라벨링을 필요로 한다. 세포 투과성 DNA 결합 염료, 염료 자전거 녹색 얼룩^{14,15,16,17을}사용하는 또 다른 대안 방법이 있지만, 이 방법은 청소년 고환으로부터 정자 유발 세포의 분리를 위해 권장된다. 따라서, 모든 연령의 마우스 변형에 적용할 수 있고 어떤 FACS 세포 선별기를 사용하여 수행될 수 있는 살아있는 메이오성 정자 세포에 대한 간단하고 강력한 격리 방법을 개발할 필요가 있다.

여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 이러한 오랫동안 추구 된 세포 격리 프로토콜을 설명합니다. DCV는 호342와 구조적으로 유사하지만 흡개 스펙트럼이 바이올렛^{범위(18)로}이동한 낮은 세포 독성, 세포 투과성 DNA 결합 염료이다. 또한 DCV는 DCG에 비해 광범위한 배기가스 스펙트럼을 가지고 있습니다. 따라서 UV와 바이올렛 레이저가 모두 흥분할 수 있어 장비의 유연성을 향상시켜 UV 레이저가 장착되지 않은 FACS 셀 선별기를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 DCV 프로토콜은 DCV 블루 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용하여 Ho342 프로토콜의 이점을 모방합니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. 우리는 한 마우스 (두 개의 고환에서) 한 마우스의 성인 마우스 고환에서 살아있는 정자 세포를 격리하기 위하여 상세한 게이팅 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 이 세포 격리를 위해 사용될 수 있는 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 효율적이고 빠른 프로토콜을 기술합니다. 절차는 완료하는 짧은 시간이 필요합니다 (단일 세포 현탁액의 준비 – 1 시간, 염색 염색 – 30 분 및 셀 정렬 – 2-3 시간 : 필요한 세포의 수에 따라 총 – 4-5 시간; 그림 1). 세포 격리에 따라 RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq 및 세포 배양을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 프로그램을 완료할 수 있습니다.