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Ambiente

Visualización bidimensional y cuantificación de labile, nutrientes vegetales inorgánicos y contaminantes en el suelo

Published: September 01, 2020
doi:
10.3791/61661
, , ,
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry,Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group,University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy,University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la visualización sub-mm 2D de múltiples especies de nutrientes inorgánicos de labile y soluto contaminante utilizando gradientes difusos en películas delgadas (DGT) combinados con imágenes de espectrometría de masas. El muestreo soluto y el análisis químico de alta resolución se describen en detalle para el mapeo cuantitativo de solutos en la rizosfera de las plantas terrestres.

Abstract

Describimos un método para la visualización y cuantificación bidimensionales (2D) de la distribución de especies inorgánicas de nutrientes inorgánicos (es decir, adsorbidos reversiblemente) (por ejemplo, P, Fe, Mn) y contaminantes (por ejemplo, As, Cd, Pb) en el suelo adyacente a las raíces vegetales (la ‘rizosfera’) a resolución espacial submilimétrica (~100 μm). El método combina el muestreo de soluto a base de fregadero por los gradientes difusivos en la técnica de películas delgadas (DGT) con el análisis químico resuelto espacialmente mediante la ablación láser inductivamente acoplada a la espectrometría de masas plasmáticas (LA-ICP-MS). La técnica de la DGT se basa en hidrogeles delgados con fases de unión análisis-selectivas distribuidas de forma homogénea. La variedad de fases de encuadernación disponibles permite la preparación de diferentes tipos de gel DGT siguiendo procedimientos sencillos de fabricación de gel. Para el despliegue de gel de la DGT en la rizosfera, las plantas se cultivan en contenedores de crecimiento planos y transparentes (rizomas), que permiten un acceso mínimo invasivo a un sistema radicular cultivado en el suelo. Después de un período previo al crecimiento, los geles de la DGT se aplican a determinadas regiones de interés para el muestreo de soluto in situ en la rizosfera. Posteriormente, se recuperan y preparan geles de la DGT para el posterior análisis químico de los solutos enlazados mediante imágenes de escaneo de línea LA-ICP-MS. La aplicación de la normalización interna mediante calibración externa de 13C utilizando estándares de gel adaptados a matrices permite además la cuantificación de los fundentes de soluto 2D. Este método es único en su capacidad para generar imágenes 2D cuantitativas a escala sub-mm de fundentes de soluto multielemento en entornos de plantas del suelo, superando sustancialmente la resolución espacial alcanzable de otros métodos para medir sustancialmente los gradientes de soluto en la rizosfera. Presentamos la aplicación y evaluación del método para la toma de imágenes de múltiples especies de solute catiónico y aniónico en la rizosfera de las plantas terrestres y destacamos la posibilidad de combinar este método con técnicas complementarias de imágenes solute.

Introduction

La adquisición de nutrientes por parte de las plantas de cultivo es un factor clave para determinar la productividad de los cultivos. Los procesos que rigen la absorción eficiente de nutrientes por parte de los cultivos se han estudiado intensamente, especialmente los mecanismos que controlan la disponibilidad de nutrientes y la internalización de nutrientes por parte de las raíces vegetales en la interfaz suelo-raíz, la rizosfera, son reconocidos por su papel en la adquisición de nutrientes de los cultivos. Los procesos importantes para la absorción de nutrientes vegetales incluyen: transporte de nutrientes hacia la raíz; equilibrios dinámicos de la sorpción entre las especies disueltas en el agua de poro del suelo y las especies unidas a superficies sólidas del suelo; competencia microbiana por los nutrientes; mineralización microbiana de nutrientes contenidos en materia orgánica del suelo; y la internalización de nutrientes en el simposio radicular. La absorción de contaminantes inorgánicos de trazas metálicas (oid) está controlada en gran medida por los mismos mecanismos.

Dependiendo de la disponibilidad de nutrientes y contaminantes, la demanda de la planta y la difusividad en el suelo, se pueden observar patrones diferenciales de nutrientes en la rizosfera. Para elementos fuertemente sorbing con tasas de internalización comparativamente altas (por ejemplo, P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), agotamiento de la fracción de elemento de labile (es decir, revertido) en comparación con el suelo a granel, con anchos de zona de agotamiento a menudo siendo ≤1 mm, mientras que para nutrientes más móviles como NO3–, las zonas de agotamiento pueden extenderse hasta varios centímetros1. Además, se ha observado la acumulación de elementos como Al y Cd cuando la disponibilidad supera las tasas de absorción de plantas2,3.

Dada la importancia de los procesos de rizosfera en el ciclo de nutrientes y contaminantes, se han desarrollado varias técnicas para medir la fracción de elementos disponibles en plantas a alta resolución espacial4,5. Sin embargo, la medición de distribuciones de labile solute a pequeña escala ha demostrado ser un desafío por varias razones. Una dificultad importante es tomar muestras de volúmenes muy pequeños (bajo rango de μL) de suelo y/o agua de poro en posiciones definidas adyacentes a las raíces de las plantas vivas para resolver los empinados gradientes de nutrientes en la rizosfera. Un enfoque para abordar este problema es utilizar tazas de micro-succión para la extracción de muestras de agua de poro6. Con este método, A. Göttlein, A. Heim y E. Matzner7 midieron las concentraciones de nutrientes del agua de poro del suelo en las proximidades de las raíces quercus robur L. a una resolución espacial de ~ 1 cm. La dificultad de analizar volúmenes de μL de solución de suelo o suelo es que estos pequeños volúmenes de muestra, en combinación con las bajas concentraciones de todas las especies de nutrientes excepto las principales, requieren técnicas de análisis químico altamente sensibles.

Un sistema alternativo, capaz de resolver gradientes de nutrientes a una resolución de hasta ~0,5 mm, es cultivar una alfombrilla de raíz en la superficie de un bloque de suelo, con una fina capa de membrana hidrófila que separa el suelo de las raíces8,9. En esta configuración, los solutos pueden pasar a través de la membrana y las raíces pueden tomar nutrientes y contaminantes del suelo, mientras que los exudados radiculares pueden difundirse en el suelo. Después del establecimiento de una capa radicular densa, el bloque de suelo se puede muestrear y cortar para obtener muestras de suelo para la posterior extracción de fracciones de elementos. De esta manera, se pueden analizar los gradientes unidimensionales de nutrientes y contaminantes, promediados en un área relativamente grande (~100 cm2).

Otro desafío es obtener muestras de la fracción de elementos labile, disponible para plantas, ya que la mayoría de las técnicas químicas de extracción de suelo funcionan de manera muy diferente en comparación con los mecanismos por los cuales las plantas toman nutrientes y contaminantes. En muchos protocolos de extracción de suelo, el suelo se mezcla con una solución extractante con el objetivo de establecer un equilibrio (pseudo)entre la fracción de elementos disueltos y helidos. Sin embargo, las plantas interiorizan continuamente los nutrientes y, por lo tanto, a menudo agotan progresivamente el suelo de la rizosfera. Aunque los protocolos de extracción de equilibrio han sido ampliamente adoptados como pruebas de suelo, ya que son fáciles de implementar, la fracción de nutrientes extraídos a menudo no representa la fracción de nutrientes disponible en la planta bien10,11,12,13. Los métodos de sumidero que agotan continuamente el suelo muestreado en busca de nutrientes se han propuesto como métodos ventajosos y pueden parecerse mejor al mecanismo subyacente de absorción de nutrientes imitando los procesos de absorción de la raíz10,11,14,15.

Además de los métodos descritos anteriormente, se han desarrollado aplicaciones de imágenes genuinas, capaces de medir mapas de parámetros continuos con resoluciones ≤100 μm a través de campos de visión de varios cm2 para elementos específicos y parámetros químicos del suelo (bio)5. La autordiografía se puede utilizar para crear imágenes de la distribución de elementos en la rizosfera siempre que haya radioisótopos adecuados disponibles16. Los optodes planos permiten visualizar parámetros químicos importantes del suelo como el pH y el pO217,18,19,y la actividad enzimática o las distribuciones totales de proteínas se pueden mapear utilizando técnicas de imagen indicadora fluorescente como lazymografía del suelo20,21,22,23 y/o métodos de hinchazón de raíces24. Mientras que lazymografía y la autordiografía se limitan a la medición de un solo parámetro a la vez, las imágenes de pH y pO2 utilizando optodes planos se pueden hacer simultáneamente. Las técnicas de alfombrilla de raíz más tradicionales proporcionan información 1D solamente, mientras que las tazas de micro succión proporcionan mediciones de puntos o información 2D de baja resolución, sin embargo ambos enfoques permiten el análisis multielemento. Más recientemente, P. D. Ilhardt, et al.25 presentó un enfoque novedoso utilizando espectroscopia de descomposición inducida por láser (LIBS) para mapear distribuciones totales de múltiples elementos 2D a una resolución de ~ 100 μm en muestras de núcleo de raíz de suelo donde la distribución del elemento natural se conservó mediante una cuidadosa preparación de muestras.

La única técnica capaz de realizar muestreos 2D específicos de múltiples solutos nutritivos y contaminantes a alta resolución espacial son los gradientes difusivos en la técnica de películas delgadas (DGT), un método de muestreo basado en sumideros que inmoviliza las especies de metales traza(loidos) de labile in situ en un material de unión incrustado en una capa de hidrogel26,27. La DGT se introdujo como técnica de especificación química para medir los solutos de labile en sedimentos y aguas, y pronto se adoptó para su uso en suelos28. Permite imágenes de solute de múltiples elementos a escala sub-mm, que inicialmente se demostró en un sedimento del río29,y se ha desarrollado aún más para su aplicación en rizosferas vegetales30,31,32,33.

Para el muestreo de la DGT, se aplica una lámina de gel de un tamaño aproximado de 3 cm x 5 cm sobre una sola raíz vegetal que está creciendo en la capa superficial de un bloque de suelo, con una membrana hidrófila que separa el gel del suelo. Durante el tiempo de contacto, los nutrientes de labile y/o contaminantes se difunden hacia el gel y se unen inmediatamente por el material de unión incorporado en el gel. De esta manera, se establece y prevalece un gradiente de concentración, y por lo tanto un flujo neto continuo hacia el gel durante el tiempo de muestreo. Después del muestreo, el hidrogel se puede quitar y analizar utilizando una técnica química analítica que permite el análisis resuelto espacialmente. Una técnica altamente especializada y de uso frecuente para este propósito es la ablación láser inductivamente acoplada espectrometría de masa plasmática (LA-ICP-MS). En algunos estudios iniciales, también se utilizó la emisión de rayos X inducida por partículas micro (PIXE)29. El muestreo de la DGT combinado con el análisis LA-ICP-MS permite imágenes químicas multielementos a una resolución espacial de ~100 μm. Si se emplean técnicas de ICP-EM altamente sensibles (por ejemplo, ICP-MS de campo sectorial), se pueden alcanzar límites de detección excepcionalmente bajos. En un estudio sobre el efecto de la limusina en Zn y Cd uptake por maíz15,pudimos mapear la labile Cd en la rizosfera de maíz en suelos no contaminados con un límite de detección de 38 pg cm-2 de Cd por área de gel. La DGT, los optodes planares y lazymografía se basan en la difusión del elemento objetivo desde el suelo hasta una capa de gel, que puede ser explotada para la aplicación combinada de estos métodos con el fin de realizar simultáneamente, o consecutivamente, la imagen de un gran número de parámetros relevantes para la absorción de nutrientes vegetales y contaminantes. Información detallada sobre los aspectos químicos analíticos de las imágenes de la DGT, sobre el potencial de combinación de la DGT y otros métodos de imagen, y sobre sus aplicaciones se revisa exhaustivamente en los puntos34,35.

En este artículo se describe cómo llevar a cabo un experimento de imágenes solute utilizando la técnica de la DGT sobre raíces de plantas terrestres en un entorno de suelo insaturado, incluyendo cultivo de plantas, fabricación de gel, aplicación de gel, análisis de gel y generación de imágenes. Todos los pasos se elaboran en detalle, incluyendo notas sobre pasos críticos y alternativas experimentales.

Protocol

1. Fabricación de geles de la DGT NOTA: Varios tipos de gel de la DGT están disponibles para imágenes 2D de especies de solute de labile a alta (sub-mm) resolución espacial35. Aquí, la fabricación de tres geles de unión de alta resolución (HR) -DGT bien caracterizados utilizados en aplicaciones de imágenes de solute se resume brevemente. Los procedimientos de laboratorio para el análisis de oligoelementos, así como los procedimientos detallados de fabricación de todos los geles HR-DGT presentados se describen en las secciones de Información de Soporte (SI) S1 y S2. Gel de unión mixta a base de poliuretano (HR-MBG; SI S2.1)31 Prepare una suspensión de gel de poliuretano con hidroóxido de circonio (IV) dispersa homogéneamente y fases de iminodiacetato (IDA). Cubra la suspensión del gel en una película delgada sobre una placa de vidrio e inicie la formación de gel mediante evaporación de disolventes para obtener un gel de unión mixta a prueba de lágrimas y aniones y cationes de 0,1 mm de grosor (HR-MBG). Gel de unión a la poliacrilamida-zirconia anion (HR-ABG; SI S2.2)36 Fabricar un gel de poliacrilamida cruzada (APA) de 0,4 mm de grosor después de los procedimientos de fundición en gel establecidos37 (véase SI S2.4 para un protocolo detallado de la fabricación de APA). Precipitar fases de hidróxido de circonio (IV) en el gel APA prefabricado para obtener un gel de unión de aniones de 0,4 mm de grosor (HR-ABG). Gel de unión de catión de poliacrilamida-iminodiacetato (HR-CBG; SI S2.3)38 Prepare una suspensión de gel de poliacrilamida con fases de IDA dispersas homogéneamente. Lance el gel entre dos placas de vidrio e inicie la reacción de polimerización para obtener un gel de unión a cationes de 0,4 mm de grosor (HR-CBG) donde las fases ida se establecen a un lado del gel. 2. Cultivo de plantas NOTA: El sistema experimental utiliza rizótrones4 (Figura 1)para cultivar plantas en suelos insaturados para imágenes de soluto. En primer lugar, se describen el llenado y riego del suelo de rizrón, luego se dan detalles sobre el crecimiento experimental de la planta. Los detalles sobre el diseño del rizoma y la preparación del sustrato del suelo antes de rellenar el rizrón se presentan en la sección SI S3. Figura 1: Diseño de rizrón (no a escala). (A) Vista explosionada de un contenedor de crecimiento de rizomas. B) Riztron ensamblado durante el crecimiento de la planta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Relleno de suelo de rizrónAntes de llenar el rizrón con suelo pre-humedecido (contenido de agua gravimétrica, , se conoce; ver SI S3.2),cerrar los abrevaderos en la parte posterior del rizoma utilizando cinta adhesiva y retirar la placa frontal y sus rieles de fijación y tornillos. Pesar el rizrón vacío (excluyendo la placa frontal, rieles y tornillos), ocho placas acrílicas de 5 cm x 11 cm y 16 abrazaderas(Tabla de Materiales)y registrar la suma de pesos. Coloque una pequeña placa acrílica en la parte inferior del rizoma utilizando dos abrazaderas a cada lado, con la presión de las abrazaderas dirigidas al marco del rizoma, para que la placa no se doble hacia adentro y el volumen sea constante. Incline el rizrón ligeramente hacia la pequeña placa de plástico y llene con tierra pre-humedecida hasta una altura de ~ 4 cm (Figura 2A). Distribuya el suelo dentro del rizrón agitando el rizoma ligeramente y comprima suavemente el suelo unos pocos mm (dependiendo de las características específicas del suelo) con una herramienta de compactación(Figura 2B). Repita 2.1.3 – 2.1.4 hasta que el rizoma esté lleno de tierra(Figura 2C). Deje un espacio de ~3 cm en la parte superior para la posterior plantación de plándas en el rizrón. Pesar el rizoma lleno de suelo (incluyendo 8 placas pequeñas y 16 abrazaderas) y registrar el peso. De esto, reste el peso rizrón vacío obtenido en 2.1.2 y registre la diferencia de peso, es decir, la masa de suelo húmedo, (g), en el rizoma. Calcular la masa de suelo seco en el rizoma, (g), según Eq. 1, y luego calcular la densidad a granel del suelo seco, (g cm-3),en el rizoma según Eq. 2.Aquí, (cm3)es el volumen interior total del rizoma.NOTA: Los valores típicos del rizrón están entre 1,0-1,4 g cm-3. No exceda de 1,5 g cm-3, ya que el crecimiento de la raíz podría verse impedido por encima de este valor. Coloque el rizrón lleno de suelo en una caja de soporte y retire todas las abrazaderas y placas pequeñas del rizoma(Figura 2D). Limpie cuidadosamente el marco del rizoma (es decir, bordes) utilizando papel tisú, ya que las partículas restantes del suelo en el marco pueden causar fugas.NOTA: La superficie expuesta del suelo debe ser homogénea y nivelada con el marco del rizrón sin grietas ni huecos. Si no es así, vacíe el rizrón y repita 2.1.2 – 2.1.8. Corte dos piezas de politetrafluoroetileno (PTFE)(Tabla de Materiales)lámina a 22 cm x 13 cm cada una. Además, corte un trozo de lámina de plástico a 46 cm x 15 cm. Registre la suma de los pesos de PTFE y láminas de plástico. Coloque la primera pieza de papel de aluminio PTFE en la mitad superior de la superficie del suelo expuesta en el rizrón, extendiéndose ~ 1 cm sobre el nivel del suelo en la parte superior del rizoma. Fije cuidadosamente la lámina de PTFE al marco de rizoma utilizando cinta adhesiva (Figura 2E). Comienza arreglando un córner en la parte superior del rizrón primero, seguido de su esquina opuesta y finalmente las dos esquinas más abajo del rizrón. Aplique tensión al fijar las esquinas 2-4 para asegurar una superficie plana de lámina. Si surgen pliegues, abra y vuelva a fijar la cinta en esquinas individuales (no todas a la vez) hasta que se retiren todos los pliegues y la lámina de PTFE sea plana y contigua con la superficie del suelo. Coloque la segunda pieza de papel de aluminio PTFE en el extremo inferior del rizrón, superponiendo la pieza superior de papel de aluminio PTFE por ~1 cm. Repita 2.1.10 para fijar la segunda lámina de PTFE al rizrón. Coloque la lámina de plástico (46 cm x 15 cm) sobre las láminas de PTFE. Fije la lámina de plástico utilizando el procedimiento de fijación como se detalla en 2.1.10. Coloque una placa frontal sobre el rizrón lleno de suelo y cubierto de papel de aluminio. Coloque un riel alrededor de cada lado del rizrón y apriete los tornillos a mano para fijar los rieles y, por lo tanto, la placa frontal al rizrón. Los tornillos se colocan hacia el lado cerrado del rizrón, es decir, el lado con los abrevaderos(Figura 1A). Figura 2: Montaje y llenado de rizomas para cultivar plantas en el suelo para la imagen de soluto en la rizosfera. (A) Relleno de suelo en el rizrón. (B) Compactación del suelo lleno utilizando una herramienta de compactación. (C) rizrón lleno de suelo con pequeñas placas acrílicas y abrazaderas. (D) rizoma relleno de suelo con superficie del suelo expuesta. (E) rizoma lleno de suelo parcialmente cubierto con una lámina protectora de PTFE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Manejo de rizomas y aplicación de gel DGT. (A) Riego del suelo utilizando puntas de pipeta de 10 ml en los abrevaderos en la parte posterior del rizrón. (B) Plantación de plántidas (indicadas como manchas verdes) en el rizrón lleno y cerrado del suelo. (C) Riztron plantado con esquejes Salix smithiana y cubierta de placa frontal y lámina de plástico retirada. (D) Pelar cuidadosamente la cubierta de la lámina de PTFE antes de la aplicación del gel de la DGT. (E) Foto de alta resolución del ROI de la interfaz tierra-raíz. (F) Aplicación de la placa frontal equipada con el gel de la DGT en el rizrón. (G) Foto del ROI con el gel de la DGT aplicado durante el muestreo de soluto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Regar el suelo Determinar la capacidad de retención de agua (WHC) del suelo experimental en el rizrón. Para ello, fabrique dos rizomas con un fondo abierto y llénelos con tierra según lo especificado en la sección 2.1. Saturar completamente estos rizomas abiertos y llenos de suelo mediante la inmersión en un recipiente de agua durante 16 h y drenar los rizomas durante 8 h. Tome una muestra de suelo compuesto de ~ 50 g de ubicaciones aleatorias en los riztrones de fondo abierto y seque la muestra a 105 °C para determinar según Eq. S1. Lo determinado corresponde a la WHC del suelo y, por lo tanto, se expresa como (g-1). Defina el objetivo en el rizoma experimental. Durante la fase de crecimiento, establezca un 60 % del WHC (es decir, el factor WHC), para suministrar a las plantas una cantidad adecuada de agua evitando al mismo tiempo condiciones anóxicas en el rizoma. Calcular la masa total de agua a añadir, (g), para irrigar el suelo en el rizrón en el objetivo según Eq. 3. Contabilizar la masa de agua presente en el suelo en el rizoma, (g). Divida por el número de abrevaderos de riztrones (aquí 14) para obtener la masa de agua que se añadirá en cada abrevadero. Agregue agua empujando puntas de pipeta de 10 ml en los abrevaderos y dejando que el agua fluya al suelo por gravedad(Figura 3A). Crecimiento de la planta Semillas pre-germinadas de la planta experimental (por ejemplo, sobre papel filtrante húmedo) de acuerdo con los requisitos específicos de germinación de semillas hasta que el radio emerge (hasta 1 cm de largo). Plantar hasta dos plándas en el rizoma como se indica en la Figura 3B. En la plantación, añadir ~ 5 ml de agua directamente a las plándas para apoyar su crecimiento. Cubra la abertura superior del rizrón durante los primeros ~dos días después de la plantación con una película transparente que retiene la humedad(Tabla de Materiales). Envuelva el rizrón en papel de aluminio para evitar el crecimiento microfísico.NOTA: Además de las plándas, los esquejes vegetales también se pueden cultivar en rizomas. Transfiera el rizoma plantado a una sala de crecimiento, con condiciones ambientales (es decir, temperatura, humedad, intensidad de luz) establecidas en los requisitos específicos de la planta. Incline el rizrón a 25°-35° para asegurar el desarrollo de la raíz junto con la placa frontal a través del gravitropismo. Durante el crecimiento de la planta, mantenga gravimétricamente el contenido objetivo de agua en el rizrón regando periódicamente cada 2-4 días utilizando los abrevaderos de rizrón como se detalla en 2.2.5. Mantenga la superficie del suelo en la abertura superior húmeda por adiciones regulares de ~ 5 ml de agua.NOTA: Si las plantas se cultivan durante períodos prolongados y se espera que la biomasa vegetal disminuya sustancialmente la cantidad de agua añadida al rizrón por el método propuesto, tenga en cuenta el peso de la biomasa vegetal cultivando plantas en réplicas de rizomas separadas y cosechando y pesando los tejidos vegetales a intervalos definidos. Una vez que las raíces lleguen a un lugar adecuado a lo largo de la placa frontal, preferentemente en el centro del rizoma, aplique geles de la DGT para el muestreo de la distribución de soluto rhizosférico. 3. Muestreo de la distribución de soluto Aplicación de gel Aumento del rizoma del 60 % al 80 % 24 h antes de la aplicación del gel, según se detalla en 2.2.4.-2.2.5. Esto garantiza un buen contacto suelo-gel y permite la difusión de soluto en el gel evitando al mismo tiempo las condiciones anóxicas del suelo durante el muestreo de soluto. Tome una nueva placa frontal limpia con ácido, alinee en el rizrón utilizado para el muestreo y marque las regiones de interés (ROIs) en la placa. Transfiera la placa a un banco de flujo laminar o a cualquier otro entorno libre de polvo y metal, sin marcar hacia arriba. Corte el gel de unión de la DGT en un soporte acrílico al tamaño rectangular requerido correspondiente al ROI, normalmente de unos 3 cm × 5 cm, utilizando cuchillas de afeitar recubiertas de PTFE. Corte el gel presionando en lugar de deslizar la cuchilla de afeitar para asegurarse de un corte claro. Coloque la pieza rectangular de gel en el lado sin marcar de la placa en la ubicación marcada del ROI.NOTA: Si se utiliza HR-MBG, se puede añadir una lámina espaciadora de 100 μm de grosor debajo del gel para garantizar que el gel esté en buen contacto con el sistema de raíz del suelo. Cortar una membrana de policarbonato de 10 μm de grosor (tamaño de poro de 0,2 μm; Tabla de materiales) a un tamaño que extiende el tamaño del gel en ≥1 cm a cada lado y colocar la membrana en el gel. Aplique un poco de agua para eliminar las burbujas de aire de la pila. Fije la membrana a lo largo de los cuatro bordes utilizando cinta eléctrica de vinilo(Tabla de Materiales). En el proceso, retire cuidadosamente las burbujas de aire atrapadas entre el gel y la membrana utilizando pinzas de plástico. La cinta sólo debe entrar en contacto con la membrana y no con el gel.NOTA: Si la cinta entra en contacto con el gel, las burbujas de aire están atrapadas entre el gel y la membrana, o la superficie final de la membrana muestra pliegues, la pila de gel/membrana debe volver a montarse ya que el flujo difusivo de los solutos en el gel puede verse afectado35 (repetir 3.1.3 – 3.1.5). Coloque el rizoma en un soporte, retire los rieles y levante cuidadosamente la placa frontal(Figura 3C). Retire la lámina de plástico, corte la lámina de PTFE en los bordes del rizrón y pele lentamente la lámina de PTFE para evitar perturbaciones del sistema de raíz del suelo(Figura 3D). Tome una foto ortogonal del ROI utilizando una cámara digital de reflejo de lente única (DSLR)(Tabla de Materiales)para facilitar la interpretación y presentación de la distribución de soluto basada en la estructura del suelo y la morfología de la raíz (Figura 3E). Utilice un soporte de cámara y, si está disponible, una lente macro. Alinee la cámara para que el centro de la foto corresponda al centro del ROI, y el plano de enfoque de la cámara es paralelo a la superficie del suelo. Incluya una barra de escala (por ejemplo, una regla) en la foto. Fije la placa equipada con la pila de gel/membrana al rizoma abierto(Figura 3F). Por lo tanto, alinee un borde de la placa con un borde del rizrón y ‘doble’ suavemente la placa hacia el suelo. Este modo de aplicación ayuda a evitar burbujas de aire entre la pila de gel/membrana y el sistema de raíz del suelo. Fije la placa frontal con los rieles y tornillos.NOTA: Este paso es crítico y debe llevarse a cabo cuidadosamente. La placa no se puede mover después de establecer el contacto entre la pila de gel/membrana y el sistema de raíz del suelo sin desplazar el suelo y las raíces. Registre la hora de inicio exacta de la implementación de gel y tome una foto del gel desplegado en el ROI como se da en 3.1.7 (Figura 3G). Envuelva el rizrón en papel de aluminio y transfiéralo a la sala de crecimiento hasta el final del período de muestreo de soluto (a menudo 24 h). Recuperación de gel Coloque el rizrón en una caja de soporte, levante cuidadosamente la placa frontal y enjuague la pila de gel/membrana en la placa con agua para lavar las partículas adherentes(Figura 4A). Registre la hora de finalización exacta de la implementación de gel. Muestree el suelo del ROI para determinar elsuelo real wen el rizrón según Eq. S1. Transfiera la placa frontal al banco de flujo laminar, apilar gel/membrana hacia arriba. Recuperar el gel de la placa frontal mediante la eliminación cuidadosa primero de la cinta a lo largo de los cuatro bordes y luego la membrana de policarbonato que cubre el gel (Figura 4B). Aplique agua para ayudar al gel a flotar libremente sobre una fina película de agua en el plato con el lado de contacto con el suelo mirando hacia arriba.NOTA: Es fundamental realizar un seguimiento de la orientación del gel. El lado del gel expuesto al suelo y las raíces siempre debe dar la cara hacia arriba (hacia el usuario). Secado en gel Cortar una pieza rectangular de papel humectante de gel(Tabla de Materiales)y colocar una pieza ligeramente más pequeña de una membrana polietilenistera (tamaño de 0,45 μm de poro; Tabla de materiales) encima. Transfiera el gel de la placa a la pila de papel/membrana humectante de gel utilizando pinzas de plástico, lado de contacto con el suelo hacia arriba. El gel debe estar relajado (es decir, no estirado) y completamente plano, sin burbujas de aire entre gel y membrana. Aplique un poco de agua en la pila de papel/membrana humectante de gel para facilitar la transferencia y posicionamiento del gel. Cubra completamente la pila de papel/membrana/gel humectante de gel con un trozo de papel de plástico y etiquete la muestra de gel y su orientación en la lámina de plástico(Figura 4C). Coloque la pila de papel/membrana/gel/papel de plástico en un secador de gel de vacío(Mesa de materiales)y séquela hasta que la pila esté completamente desecada (normalmente 48-72 h). Para HR-MBG, ajuste la temperatura a 50-55 °C, para HR-ABG y HR-CBG mejor secar a temperatura ambiente. Retire el papel humectante de gel de la pila seca y transfiera el gel, que ahora se fusiona inseparablemente con la membrana polietersulfone, en una bolsa de cremallera. La cubierta de lámina de plástico permanece en el gel hasta poco antes del análisis la-ICP-MS. Incluya una pieza de gel de la hoja de gel original como método en blanco, que no se expone al suelo. Procese el método gel en blanco idéntico al gel de muestra después de 3.3.2 – 3.3.4. Figura 4: Recuperación de gel de la DGT y preparación para el secado tras el muestreo de soluto. (A) Placa con gel de la DGT y rizoma directamente después del muestreo de soluto. (B) Recuperación del gel de la DGT de la placa en un banco de flujo laminar. (C) Pila de papel humectante de gel/membrana polietilesulfone/cubierta de gel/papel de plástico DGT para secado en gel. Tenga en cuenta que el gel está ligeramente coloreado después de su despliegue en el suelo de la rizosfera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Análisis químico del gel de unión de la DGT NOTA: En este protocolo, el análisis de la distribución de soluto en el gel de encuadernación de la DGT se realiza mediante LA-ICP-MS utilizando un sistema de 193 nm de ArF excimer LA equipado con una célula de ablación de dos volúmenes acoplada a un ICP-MS cuadrúpedo (Figura 5). Todos los instrumentos se enumeran en la Tabla de Materiales. Alternativamente, los sistemas de LA de estado sólido nanosegundos de 213 nm o 266 nm se pueden aplicar36,39,40,41,42,43. Si se requiere una mayor sensibilidad o resolución de masas, el campo sectorial ICP-MS es una alternativa al cuadrúpedo ICP-MS15,44. Los detalles sobre la preparación de las normas de gel de la DGT para la calibración externa y el acoplamiento del sistema LA al ICP-MS cuadrúpedo se presentan en las secciones SI S4 y S5. Figura 5: Configuración de LA-ICP-MS para el análisis de gel de la DGT. (A) Nanosegundo 193 nm ArF excimer LA sistema y cuadrúpedo ICP-MS. B) Geles secos montados en placas de vidrio y fijados en la etapa de muestra de Los Ángeles listos para su introducción en la célula de ablación. (C) Gas nebulizador (Ar) de ICP-MS y gas portador de aerosol (Él o Ar) de celda de ablación conectada al ICP a través de un splitter Y bidireccional y un accesorio adaptador de antorcha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de muestras para LA-ICP-MS Transfiera las muestras de gel seco, los estándares y los espacios en blanco del método (que se fusionan con el soporte de membrana polietilenófone) en piezas individuales de cinta adhesiva de doble cara(Tabla de Materiales),lado de gel hacia arriba. Recorte el exceso de piezas de cinta para ahorrar espacio en la celda de ablación. Monte los geles secos en placas de vidrio. Utilice placas de vidrio individuales para cada muestra de gel, serie estándar o método en blanco para permitir una disposición flexible en la etapa de muestra de Los Ángeles (tamaño típico de 10 cm × 10 cm). Utilice un cristal para ajustar el tamaño de la placa de vidrio según sea necesario. Fije las placas de vidrio con los geles en la etapa de muestra de Los Ángeles (Figura 5B) utilizando plasticina (Tabla de Materiales). Nivele la superficie del gel ajustando el suelo del escenario y bloquee la etapa de la muestra en la celda de ablación. Análisis de escaneo de línea LA-ICP-MSAcopla el sistema LA al ICP-MS según lo especificado en la sección SI S5. En el software LA(Tabla de materiales),ajuste los ajustes de luz de la cámara (es decir, ‘Anillo’, ‘Coax’ y ‘Transmitido’) para iluminar la superficie del gel en la celda de ablación y centrarse en la superficie del gel mediante el ajuste de la distancia del eje z. Muévase a ubicaciones aleatorias a través de la celda para asegurarse de que todas las superficies de gel estén enfocadas. Establezca los parámetros LA en la ventana’Configuración láser’del software LA. Los ajustes típicos utilizados en el análisis de escaneo de línea LA-ICP-MS de los geles de la DGT son: modo continuo; producción de energía 20-30%; tasa de repetición 10-20 Hz; diámetro puntual 100-200 μm; velocidad de escaneo 150-250 μm s-1.NOTA: Los parámetros deben optimizarse para el tipo de gel utilizado y pueden variar. Los parámetros también se pueden mejorar para aumentar la relación señal-ruido, la resolución espacial o reducir los tiempos de adquisición dependiendo de la configuración experimental e instrumental. Utilice una producción de energía relativamente baja (≤40 %) y tasa de repetición (≤25 Hz) para evitar penetrar a través de los geles en los materiales de respaldo39. Asegúrese de que la velocidad de escaneo láser se ≤ el diámetro del punto dividido por la duración total del ciclo de escaneo ICP-MS (véase 4.2.6) para evitar la compresión de los puntos de datos y, por lo tanto, una pérdida de resolución en la dirección de escaneo45. Por ejemplo, al establecer un diámetro de punto de 200 μm y una duración total del ciclo de escaneo ICP-MS de 0,25 s, la velocidad de escaneo debe ser ≤800 μm s-1. Seleccione la herramienta de línea y dibuje un patrón de línea de un solo, ~ 1 mm de largo a través de un estándar de gel. Haga clic con el botón derecho en el patrón de línea en la ventana ‘Patrones de escaneo’ y verifique que los parámetros LA establecidos en 4.2.3. han sido adoptados. Utilice la herramienta ‘Escaneos duplicados’ para duplicar esta línea cuatro veces, con una distancia entre líneas (distancia entre el centro de línea) mayor que el diámetro del punto (Figura 6). Este enfoque ofrece un total de cinco líneas paralelas por estándar de gel (n = 5). Repita este paso para cada estándar de gel, calibración en blanco y método en blanco. Vaya a la muestra de gel y dibuje una sola línea a lo largo del borde superior del área rectangular que desea analizar. Duplique la línea para crear líneas paralelas para todo el área de muestra especificada en 4.2.3. Utilice una distancia interlínea de 300-400 μm. Asegúrese de que el enfoque (distancia del eje z) esté configurado correctamente para cada punto inicial y final de cada línea.NOTA: La resolución espacial del análisis es mayor a lo largo de la dirección del escaneo en comparación con la distancia entre líneas. Por lo tanto, los puntos inicial y final de las líneas pueden seguir mejor la dirección de los degradados de analitos. Para los gradientes de rizosfera, esto suele ser perpendicular al eje raíz (Figura 6). En el software ICP-MS (Tabla de materiales), configure un método’Sólo datos’resuelto en el tiempo resuelto en la pantalla’Método’,seleccione uno o más isótopos adecuados para cada analito e incluya 13C como estándar de normalización interna31,36,40,41,42. Verifique que la detección de los isótopos no se vea afectada por las interferencias46. Establezca la duración total del ciclo de escaneo del método ICP-MS (‘Tiempo de lectura est.’) en ≤0,5 s con tiempos de permanencia adecuados por isótopo (normalmente entre 10-50 ms). Establezca el valor ICP-MS ‘Lecturas’ en 1 y cambie el valor ‘Lecturas/Replicar’ para establecer el tiempo de medición total por muestra (‘ Tiempo demuestreo est.’),es decir, por línea de ablación individual. Esto depende de los parámetros específicos de LA y las distancias de línea establecidas en 4.2.2 – 4.2.4. Para los informes de datos, utilice un modo de recopilación de datos de intensidad frente a tiempo y establezca laopción ‘ Escritura de archivos’ en ‘ Nuevo porejemplo’ para crear un archivo de datos individual (aquí .xl) para cada línea de ablación. Configure una secuencia de muestra ‘Lote’ en la pantalla ICP-MS ‘Muestra’ , con cada entrada de muestra correspondiente a una línea de ablación individual establecida en 4.2.3 – 4.2.4. Haga clic en ‘Analizar lote’ para iniciar la secuencia de muestra en el ICP-MS, que esperará con la adquisición de datos hasta que se active por el primer pulso láser (consulte SI S5 para obtener más información sobre la configuración del disparador). En el software LA, seleccione todas las líneas que desea analizar y compruebe que el método ICP-MS (‘Tiempo de muestreo est.’, véase 4.2.6.) coincide con la duración de las ablaciones de línea individuales, que normalmente es diferente para muestras de gel, estándares y espacios en blanco del método. Repita 4.2.6. para ajustar el método ICP-MS si es necesario. Haga clic en ‘Emisión’ en la ventana ‘Energía láser’ para recargar el cabezal láser, y luego haga clic en ‘Ejecutar’ para abrir la ventana ‘Ejecutar experimento’. Aquí, seleccione ‘ Sólo patrones seleccionados ‘, establezca el ‘Retardo de lavado’ en 20-30 s, marque el ‘Habilitar láser durante los escaneos’ caja, y establecer el ‘ Tiempo de calentamientoláser’ en 10 s. Haga clic en ‘Ejecutar’ en la ventana ‘Ejecutar experimento’ para iniciar el análisis de escaneo de línea y supervisar la intensidad de la señal sin procesar en recuentos por segundo (cps) para cada isótopo en el ICP-MS en tiempo real. Cada línea debe comenzar (‘Tiempo de calentamiento láser’, 10 s) y finalizar (‘Retardo de lavado’, 20-30 s) con un gas en blanco. Monitoree la fluencia láser (J cm-2)durante el análisis para evaluar la estabilidad del láser. Si la fluidez varía en gran medida, aborte el análisis y verifique que la fuente láser y/o su sistema de espejos sean completamente funcionales. Después del análisis, detenga el plasma ICP-MS y fije el caudal de gas portador en el sistema LA a 0 mL min-1. Retire los geles de la celda de ablación y guárdelos en bolsas con cremallera para su uso posterior. Figura 6: Esquema del diseño experimental DE LA-ICP-MS de la DGT (no a escala). La ilustración muestra el muestreo de soluto in situ basado en la DGT en la rizosfera y el mapeo LA-ICP-MS de la distribución de soluto en la superficie del gel, incluyendo un primer plano que muestra dimensiones y parámetros ejemplares de escaneo de línea. Tenga en cuenta que el gel de la DGT se voltea horizontalmente cuando se transfiere desde el suelo de la rizosfera a la placa de vidrio, como indica la posición del rectángulo en la esquina inferior del gel de la DGT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Procesamiento y calibración de datos Importe el archivo de datos sin procesar (.xl) para cada línea en llamas en el software de hoja de cálculo (Tabla de materiales). La tabla de datos sin procesar muestra las lecturas ICP-MS (puntos de datos) para cada isótopo en cps y los puntos de tiempo correspondientes en s. Enumere todas las líneas una al lado de la otra en columnas diferentes. Evalúe los datos de escaneo de línea para la estabilidad de la señal de la norma interna(13C) y los tiempos de lavado adecuados. Calcule un gas medio en blanco para cada isótopo a partir de todos los valores en blanco de gas registrados antes de las ablaciones de línea (es decir, durante el tiempo de calentamiento del láser) y reste el gas medio en blanco de las intensidades brutas correspondientes para cada isótopo para corregir la señal de fondo. Aplique la normalización interna dividiendo la intensidad de la señal de cada isótopo (cps) por la intensidad de la señal de la norma interna (cps) para que cada punto de datos corrija las variaciones en la cantidad de material ablated y la deriva instrumental. Recorte los datos antes del inicio y después del final de cada línea en llamas para eliminar la señal de fondo. Transponga la tabla de datos para obtener una matriz de cuadrícula donde cada fila corresponda a una línea en llamas y cada columna a un valor de intensidad de isótopo normalizado. Separe las matrices de cada isótopo en hojas de trabajo individuales. Calcule la relación media de intensidad normalizada de la señal por isótopo para los estándares de calibración y la calibración en blanco y calcule la función de calibración (y = ax + b) utilizando un modelo de regresión lineal con las cargas de analito estándar de gel (μg cm-2; ver SI S4) como valores x. Evaluar la función de calibración de cada isótopo para linealidad47. Aplique la función de calibración a la matriz de datos de muestra. Convertir las relaciones de intensidad de señal normalizada, , en cargas de analitos de gel, (μg cm-2), y posteriormente a fundentes de soluto promediados en el tiempo, (pg cm-2 s-1),para cada isótopo y punto de datos según Eq. 4 y Eq. 5:Aquí, a es la pendiente de la línea de calibración, b es la intercepción de la línea de calibración, y t (s) es el tiempo de despliegue de gel durante el muestreo de soluto. Guarde la matriz de datos de ejemplo calibrada para cada analito como archivo txt. Generación de imágenesNOTA: Asegúrese de evitar cualquier operación de interpolación de píxeles durante todos los pasos de generación de imágenes, ya que esto puede conducir a degradados de flujo de soluto suavizados artificialmente en las imágenes resultantes. Importe la matriz de datos de muestra calibrada (.txt) como imagen de texto en el software de análisis de imágenes (Tabla de materiales). Calcule la distancia por píxel en dirección X (es decir, resolución lateral) multiplicando la velocidad de escaneo láser con la duración total del ciclo de escaneo ICP-MS (por ejemplo, suponiendo una velocidad de escaneo de 200 μm s-1 y una duración total del ciclo de escaneo de 0,25 s, la resolución lateral equivale a 50 μm). La distancia por píxel en dirección y equivale a la distancia entre líneas (Figura 6). Calcule el factor de corrección de relación de aspecto de la imagen. Por lo tanto, divida la distancia por píxel en dirección y (por ejemplo, 300 μm) por la distancia por píxel en dirección X (por ejemplo, 50 μm). Aplique el factor de corrección y/x obtenido (en este ejemplo 6) en ‘Escala’. Aplique la distancia por píxel (en μm o mm) en dirección x como escala en ‘Establecer escala’. Aplique una’Tabla de búsqueda’,es decir, una escala pseudocolor para una mejor visualización de los degradados químicos en la imagen solute y ajuste el ‘equilibrio de color’ de la imagen para controlar los límites inferiores/superiores del rango de visualización. Añade una ‘barra de calibración’ y guarda la imagen de solute como tiff-file. Copie la imagen solute mediante el comando ‘Copiar al sistema’ en el software de análisis de imágenes y pegar en software de publicación de escritorio ( Tabla demateriales). Alinee, alinee y componga la imagen de solute con la foto del ROI obtenida en 3.1.7.NOTA: Antes de copiar, cambiar el tamaño de la imagen solute, por ejemplo, factor 10 mediante la aplicación de una ‘Escala X’ de 10 y una ‘Escala Y’ de 10 bajo ‘ Escalaestablecida’ para garantizar píxeles suficientes para la publicación de alta resolución. Fabricación de gel de la DGT Cultivo de plantas Muestreo de soluto in situ Mapeo de flujo de soluto LA-ICP-MS HR-MBG1 semana Preparación del suelo1 semana Aplicación de gel1 hora por gel Preparación de muestras1 hora por gel HR-ABG3 días Montaje de rizrón2 horas por réplica Período de muestreo de Solutevariable, normalmente 24 horas Análisis de LA-ICP-MS1 día por gel HR-CBG3 días Crecimiento de la plantadependiente del estudio Recuperación de gel1 hora por gel procesamiento de datos4 horas por gel Secado en gel2-3 días Generación de imágenes10 min por imagen Tabla 1: Tiempos aproximados para los pasos generales de la técnica LA-ICP-MS de la DGT.

Representative Results

Para demostrar la capacidad y el detalle de datos del método de imagen de la DGT, recopilamos la distribución de flujo 2D sub-mm de múltiples especies de nutrientes de labile y soluto contaminante en suelos adyacentes a raíces de Fagopyrum esculentum y Salix smithiana (Figura 7). Los tiempos aproximados para los pasos procedimentales generales del protocolo se presentan en el cuadro 1. Las imágenes de Solute en la Figura 7 se generaron en tres estudios diferentes utilizando geles de encuadernación HR-MBG o HR-CBG. Las imágenes químicas muestran la distribución del flujo de soluto 2D a una resolución espacial de 82-120 μm a lo largo del eje X y 300-400 μm a lo largo del eje y, dependiendo de los parámetros LA-ICP-MS utilizados. Dado que no se aplicó ninguna interpolación durante la calibración y el tamaño de la imagen, los píxeles individuales representan puntos de datos medidos. La alineación de las imágenes solute con una imagen fotográfica del ROI revela que la distribución de flujo de soluto 2D sub-mm de diferentes elementos es altamente variable según la estructura del suelo y la morfología de las raíces. Esto puede atribuirse al comportamiento biogeoquímico diferencial de los elementos del sistema suelo-rizosfera-planta, y a su interacción con la matriz del suelo y las raíces vegetales. En la Figura 7A se visualizaron los fundentes labile inorgánicos Mg, Al, P, Mn y Fe solute alrededor de una joven raíz F. esculentum cultivada en suelo libre de carbonato fertilizado con NH4NO3. La distribución de soluto sub-mm mostró zonas de disminución de los fundentes Al, P y Fe junto con las secciones radiculares más antiguas debido a la absorción de raíces, y el aumento elevado de los fundentes Mg, Al, P, Mn y Fe en el ápice radicular debido a los procesos de movilización P localizados de la raíz F. esculentum. Tenga en cuenta que la punta de la raíz se encuentra un poco detrás de la superficie del suelo y por lo tanto apenas visible en la imagen fotográfica. La Figura 7B muestra la distribución de metales traza de labile, incluyendo Mn, Fe, Zn, Cd y Pb alrededor de una raíz de S. smithiana tolerante al metal cultivada en un suelo moderadamente contaminado con Zn, Cd y Pb. Las imágenes de solute visualizaron un marcado agotamiento particularmente de Zn, Cd y Pb en la posición de raíz inmediata, mostrando que las raíces de S. smithiana actúan como un fregadero localizado para los metales traza de labile en suelo contaminado. Además, se pueden observar aumentos localizados de flujo de Zn, Cd y Pb, lo que indica la acumulación de estos metales traza en la interfaz inmediata tierra-raíz. Además de las imágenes de solute multis elementales, el método presentado también se puede combinar con técnicas complementarias de imágenes basadas en difusión, como los optodes planos34. Esto se demuestra en la Figura 7C,donde la distribución de metales traza de labile en la rizosfera de S. smithiana fue co-localizada con la distribución de pH utilizando un gel combinado de unión a la cation optode-DGT de una sola capa33. El sustrato del suelo fue fertilizado con (NH4)2SO4,lo que conduce a una disminución del pH a lo largo de los ejes radiculares en ~1 unidad en comparación con el suelo a granel. Las disminuciones del pH fueron co-localizadas con el aumento de los flujos de soluto de Mn, Fe, Co, Ni, Cu y Pb, lo que sugiere solubilización metálica inducida por pH. Además, estos resultados de ejemplo muestran algunos de los artefactos potenciales de imagen que se pueden obtener. Por ejemplo, las inhomogeneidades estructurales del suelo, por ejemplo, observadas como una línea horizontal en el tercio inferior de la imagen roi de la Figura 7A, pueden causar discontinuidades de contacto suelo-gel que resultan en una difusión limitada en este lugar en el gel de unión. Por el contrario, la compactación excesiva del suelo en el rizoma puede conducir a una mala porosidad, lo que resulta en un cambio artificial del estado del redox del suelo hacia la anoxia. Esto se ilustra en la Figura 7B,donde extensas áreas de fundentes Mn y Fe altamente elevadas en las imágenes de soluto se combinan visualmente con una densa capa de suelo en la imagen roi. Esto sugiere una disminución del potencial de redox del suelo debido a la alta compactación del suelo, lo que resulta en la disolución reductiva y la solubilización de los elementos altamente sensibles al redox. Por lo tanto, se recomienda un cuidadoso llenado de riztrones e inspección visual de la superficie del suelo directamente después del llenado. Figura 7: Distribución sub-mm 2D de especies de nutrientes de labile y soluto contaminante a través de diferentes interfaces de raíz del suelo. (A) Distribución de P aisónico y mg catiónico, Al, Mn, y Fe solutes alrededor de una joven raíz F. esculentum. El muestreo co-localizado de solutes aisónicos y catiónicos se logró usando HR-MBG durante 24 h en una saturación de agua del suelo de ~75% WHC. Las imágenes Al, P y Mn se muestran como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1),mientras que las imágenes Mg y Fe muestran 13intensidades normalizadas en C. La barra de escala representa 1 cm. Esta cifra está adaptada a partir de la referencia48. B) La distribución de Mn, Fe, Zn, Cd y Pb alrededor de una raíz de S. smithiana cultivada en suelo moderadamente contaminado con solutes de metal traza Cationic de Zn, Cd y Pb. se muestreó usando HR-CBG durante 20 h a una saturación de agua del suelo de ~80 % WHC. Todas las imágenes se muestran como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1). La barra de escala representa 0,5 cm. Esta cifra está adaptada de la referencia3. (C) La distribución de pH y múltiples solutos catiónicos alrededor de las raíces S. smithiana cultivadas en suelos con picos de Cd. Co-localización de pH y dinámica de soluto se logró mediante una modificación del protocolo HR-MBG, permitiendo el muestreo soluto simultáneo y la imagen de optodo plano33. Las imágenes Mn, Cu, Zn y Cd se muestran como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1),mientras que las imágenes Fe, Co, Ni y Pb muestran 13intensidades normalizadas en C. La barra de escala representa 1 cm. Esta cifra está adaptada a partir de la referencia33. Las cifras presentadas se reproducen a partir de los artículos citados3,33,48 licenciados en virtud de CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Archivo suplementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo de imagen de soluto presentado aquí es un método versátil para visualizar y cuantificar los nutrientes 2D y los fundentes contaminantes en entornos de plantas del suelo. Es único en su capacidad para generar imágenes multielementos a escala sub-mm de especies de labile solute en la interfaz tierra-raíz, superando la resolución espacial alcanzable de métodos alternativos para medir gradientes de soluto en la rizosfera sustancialmente4. El enfoque de muestreo in situ específico de la DGT, en combinación con un método de análisis químico altamente sensible como LA-ICP-MS, facilita la investigación detallada de la dinámica del flujo de soluto en torno a raíces vegetales individuales cultivadas en el suelo o sustratos similares. Debido al proceso de muestreo a base de fregadero, las imágenes obtenidas reflejan la labilidad de los solutos visualizados y, por lo tanto, son una estimación de su disponibilidad vegetal10. Aunque la medición inherente al método de los fundentes de soluto tiene ventajas considerables como la interpretabilidad como fracciones de nutrientes disponibles en las plantas, las mediciones de flujo son mucho menos directas de entender que las mediciones de concentración de agua de poro. La geometría estándar de muestreo de la DGT en aplicaciones de suelo a granel (concretamente los geles de difusión de 0,8 mm de espesor utilizados en dicha configuración) permite comparar la concentración real de agua de poro, csoln,y una estimación de concentración de agua de poro de media en tiempo por una medición masiva de la DGT, cDGT,y para la interpretación de estos parámetros con respecto a la dinámica de reabastecimiento de una especie de soluto. Sin embargo, esta comparación no puede realizarse en función de la aplicación de imagen DGT con capas de difusión muy delgadas, ya que los valores derivados delaDGT son irrealmente pequeños34. Por lo tanto, los resultados de las imágenes de la DGT no siempre son sencillos y rápidos de interpretar y a menudo no son directamente comparables a las mediciones de concentración de agua de poro más convencionales.

Al aplicar el método, algunos pasos críticos deben ser cuidadosamente considerados, principalmente relacionados con el llenado y riego de los contenedores de crecimiento de rizótrones. Durante el llenado del suelo en el rizoma, es muy importante evitar compactar el suelo demasiado, ya que las raíces de la planta no pueden penetrar suelo fuertemente compactado y el crecimiento de las raíces se inhibirá. Hemos observado raíces evitando el suelo fuertemente compactado y creciendo a lo largo de los bordes internos del recipiente de crecimiento de rizomas, donde el suelo suele ser menos compactado. En este caso, las raíces individuales ubicadas en el centro de los rizomas, donde los geles de la DGT se pueden aplicar convenientemente, pueden no desarrollarse en absoluto, inhibiendo eficazmente la aplicación exitosa del gel. En nuestro laboratorio, la experiencia demostró que las densidades a granel del suelo seco de 1.0-1.4 g cm-3 permiten el desarrollo de raíces sin obstáculos. Además, la compactación excesiva del suelo es también una fuente potencial de artefactos con respecto a la solubilidad de los elementos sensibles al redox y las especies asociadas biogeoquímicamente. A medida que se reduce el volumen total del poro y la distribución del diámetro del poro se desplaza hacia diámetros más bajos en suelos altamente compactados, se dispone de menos volumen de poros de mayor diámetro lleno de aire, lo que puede conducir a condiciones reductivas localmente. En consecuencia, los óxidos MnIII/IV– y FeIII– pueden reducirse, lo que conduce a un aumento de los fundentes Mn2+ y Fe2+. La disolución de los óxidos de fe, que son sitios de sorpción importantes, por ejemplo, para fosfato y micronutrientes, puede liberar especies hechiceras y/o co-precipitadas y, por lo tanto, causar fundentes artificialmente elevados de las especies asociadas biogeoquímicamente. Puede surgir un problema similar si los recipientes de crecimiento se riegan demasiado. La evaporación a través de la pequeña superficie del suelo en la parte superior del recipiente de crecimiento es baja y el suelo puede permanecer saturado de agua hasta varias semanas después de la plantación, lo que también puede causar artefactos redox.

Otra consideración importante es la funcionalidad química del gel de encuadernación HR-DGT fabricado. Siguiendo el protocolo, se obtienen geles delgados con una distribución homogénea de las fases de unión. Si los geles tienen áreas de distribución de material inhomógeno (por ejemplo, agujeros en el gel o agregados de fases de unión) estas áreas deben eliminarse o, si son demasiado extensas, es necesario repetir el protocolo de fabricación de gel. Si se prepara correctamente, el gel debe ser capaz de unir las especies de solute objetivo que se difunden en el gel inmediatamente y cuantitativamente27, que está determinado por la capacidad de unión de gel específica del analito. Si bien exceder la capacidad del gel es menos problemático en suelos no contaminados, debe considerarse en suelos contaminados con metales y ambientes de suelo salino. La saturación de las fases de unión al gel no sólo perjudicará el muestreo cuantitativo de soluto, sino que también dará lugar a la difusión lateral de solutes entre fases de unión en el gel, lo que conducirá a una localización indefinida de las características de flujo de soluto a pequeña escala. Por lo tanto, si se esperan cantidades muy altas de especies de nutrientes/contaminantes de labile en el entorno del suelo objetivo, se deben realizar pruebas preliminares. Para estimar las cargas esperadas de la DGT, se pueden aplicar muestreos a granel del pistón de la DGT seguidos de elución de gel y análisis wet-chemical15,49. Si es necesario, los tiempos de despliegue de la DGT pueden ajustarse para reducir el tiempo de contacto del gel y evitar así la saturación de gel por encima de los umbrales de capacidad. Por el contrario, las pruebas preliminares también pueden ser útiles para identificar los tiempos de contacto de gel requeridos y/o sensibilidades LA-ICP-MS si se esperan cargas de soluto muy bajas, lo que puede ser importante para mapear los solutos de oligoelementos en los niveles de fondo del suelo natural15. Además, se debe verificar el correcto funcionamiento del gel de la DGT antes de su aplicación experimental mediante la carga controlada de geles en la preparación de las normas de calibración DE LA-ICP-MS de la DGT. El estándar de gel proporciona una carga de analito de gel de referencia adaptada a matrices que se puede utilizar para evaluar si la carga del gel de muestra determinada por LA-ICP-MS está dentro del rango esperado. Si no se puede obtener una señal diferente del ruido de fondo en blanco de gas y método, el operador debe asegurarse de que se implementaron procedimientos de laboratorio para el análisis de oligoelementos y todos los pasos de protocolo se realizaron correctamente. A veces, el gel de la DGT se voltea accidentalmente después del muestreo de soluto con el lado expuesto al suelo, cargado hacia la placa de vidrio en lugar del rayo láser, lo que resulta en intensidades de señal bajas y características erróneamente volteadas en las imágenes finales de flujo de soluto.

Durante el análisis LA-ICP-MS, se genera una gran cantidad de datos, lo que tarda mucho tiempo en evaluarse. En nuestro laboratorio, utilizamos scripts internos de evaluación de datos adaptados a nuestro formato de salida de datos de destino mediante software de hoja de cálculo estándar. Después de la ordenación y calibración semiautomáticas, el trazado de imágenes se lleva a cabo utilizando herramientas de análisis de imágenes de código abierto y acceso abierto (ImageJ, Fiji50). Este enfoque permite un control total sobre la clasificación, evaluación y presentación de datos, lo cual es esencial porque los datos recopilados corresponden a píxeles rectangulares y no cuadráticos, que deben mostrarse correctamente en los mapas de soluto generados. Además, durante el procesamiento de datos, cualquier interpolación de píxeles debe evitarse cuidadosamente. La interpolación de píxeles conduce a degradados suavizados en las imágenes químicas, lo que resulta en entidades de distribución de elementos suavizadas, a menudo circulares, y por lo tanto es una alteración indeseable de los datos originales. La interpolación de píxeles es un procedimiento estándar para volver a escalar y volver a formatear las operaciones en muchos productos de software de procesamiento de imágenes, pero se puede anular la selección normalmente.

En conclusión, el método descrito es un avance significativo para entender la dinámica de nutrientes y contaminantes en los sistemas naturales de plantas de rizosfera del suelo. Además de las aplicaciones solo de la DGT, el método se puede combinar con otras técnicas de imagen basadas en difusión como los optodes planares3,33,42,43,48,51 y lazymografía20,21,22,23,24,y puede desarrollarse aún más para incluir elementos adicionales y parámetros del suelo.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue cofinanciado por el Fondo Austriaco de Ciencia (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) y el Fondo Austriaco de Ciencias (FWF) y el Estado Federal de Baja Austria: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
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Riferimenti

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Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).
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