Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten
Summary
Dieses Protokoll bietet Methoden zur Visualisierung von Bakterienzellen und Polysaccharid-Syntheselocus (Psl)-Polysacchariden im Sputum von Mukoviszidose-Patienten.
Abstract
Die frühzeitige Erkennung und Eradikation von Pseudomonas aeruginosa in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten kann das Risiko einer chronischen Infektion verringern. Die Entwicklung chronischer P. aeruginosa-Infektionen ist mit einer Abnahme der Lungenfunktion und einer erhöhten Morbidität verbunden. Daher besteht ein großes Interesse an der Aufklärung der Gründe für das Scheitern der Eradikation von P. aeruginosa mit einer antibiotischen Therapie, die bei etwa 10-40% der pädiatrischen Patienten auftritt. Einer von vielen Faktoren, die die Wirtsclearance von P. aeruginosa und die Antibiotikaempfindlichkeit beeinflussen können, sind Variationen in der räumlichen Organisation (z. B. Aggregation oder Biofilmbildung) und der Polysaccharidproduktion. Daher waren wir daran interessiert, die in situ Charakteristika von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten sichtbar zu machen. Eine Gewebereinigungstechnik wurde auf Sputumproben angewendet, nachdem die Proben in eine Hydrogelmatrix eingebettet wurden, um die 3D-Strukturen relativ zu den Wirtszellen zu erhalten. Nach der Gewebereinigung wurden fluoreszierende Markierungen und Farbstoffe hinzugefügt, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Bakterienzellen, Bindung von fluoreszenzmarkierten Anti-Psl-Antikörpern zur Visualisierung des Exopolysaccharids und DAPI-Färbung zur Färbung von Wirtszellen, um strukturelle Einblicke zu erhalten. Diese Methoden ermöglichten die hochauflösende Bildgebung von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.
Introduction
In dieser Studie wurden Experimente durchgeführt, um die in vivo Struktur von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von pädiatrischen Mukoviszidose-Patienten (CF) sichtbar zu machen. P. aeruginosa-Infektionen werden bei 30-40% der pädiatrischen Mukoviszidose-Bevölkerung chronisch; Wenn sich chronische Infektionen erst einmal etabliert haben, sind sie fast unmöglich zu beseitigen1. P. aeruginosa-Isolate von Patienten mit früher Infektion sind im Allgemeinen anfälliger für antimikrobielle Mittel, daher werden diese mit anti-pseudomonalen Antibiotika behandelt, um die Etablierung einer chronischen Infektion zu verhindern2. Leider werden nicht alle P. aeruginosa-Isolate nach einer Antibiotikatherapie effektiv aus der Lunge entfernt. Die genauen Mechanismen, die mit dem Versagen von Antibiotika verbunden sind, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Variationen in der Zelldichte, der Aggregation und der Polysaccharidproduktion die Wirksamkeit von Antibiotika beeinträchtigen können3. P. aeruginosa produziert drei extrazelluläre Polysaccharide: Pel, Psl und Alginat4. Die meisten Stämme von P. aeruginosa haben die genetische Fähigkeit, jedes der Exopolysaccharide zu exprimieren, obwohl oft ein Polysaccharidtyp überwiegend exprimiert wird5. Das Exopolysaccharid Alginat ist mit chronischen Infektionen in der Mukoviszidose-Lunge assoziiert, was zu einem mukoiden Phänotyp 6,7 führt. Die Polysaccharide Pel und Psl haben mehrere Funktionen, darunter die Unterstützung der anfänglichen Anheftung und der Aufrechterhaltung der Biofilmstruktur sowie die Verleihung von Antibiotikaresistenz8.
Methoden zur Visualisierung von In-vivo-Strukturen von Geweben wurden für eine Vielzahl von Probentypen entwickelt 9,10,11. In jüngerer Zeit wurden sie darauf zugeschnitten, mikrobielle Gemeinschaften in vivo im Sputum von Mukoviszidose-Patienten sichtbar zu machen12. Die Optimierung eines Gewebe-Clearing-Protokolls speziell für die Identifizierung von mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des Sputums wurde von DePas et al., 201612 entwickelt. Der Begriff MiPACT, der für Mikrobial identification after Passive CLARITY technique steht, wurde für die Klärung von Mukoviszidose-Sputumgeprägt 11,12. Bei Gewebereinigungstechniken werden die Proben zunächst fixiert und dann transparent gemacht, wobei ihre inhärente Architektur für die Färbung und mikroskopische Visualisierung intakt bleibt11. Die Fixierung und Klärung von Mukoviszidose-Sputumproben ermöglicht es den Forschern, Fragen im Zusammenhang mit der Biofilmstruktur, der bakteriellen Zelldichte, polymikrobiellen Assoziationen und Assoziationen zwischen Krankheitserregern und Wirtszellen zu beantworten. Der Vorteil der direkten Untersuchung von Bakterien, die im Sputum konserviert wurden, besteht darin, dass sie in einem wirtsspezifischen Kontext analysiert und visualisiert werden können. Obwohl die In-vitro-Züchtung klinischer Isolate im Labor für Experimente sehr aufschlussreich sein kann, sind solche Methoden nicht in der Lage, die Mukoviszidose-Lungenumgebung vollständig nachzubilden, was zu einer Diskrepanz zwischen Laborergebnissen und Patientenergebnissen führt.
Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um Sputum zu fixieren und zu reinigen, um Bakterien sichtbar zu machen, sei es von Mukoviszidose-Patienten oder Patienten mit anderen Atemwegsinfektionen. Die spezifische Art der Färbung und mikroskopischen Analyse, die hier beschrieben wird, ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt von der Bindung von Anti-Psl-Antikörpern innerhalb des Hydrogels und der anschließenden Analyse mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM). Nach der Gewebereinigung können auch andere immunhistochemische und mikroskopische Methoden angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zweck dieses Protokolls ist es, einen Einblick in die in-situ Organisation von P. aeruginosa-Zellen im Sputum von Mukoviszidose-Patienten zu ermöglichen. Sputumproben sollten bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort fixiert werden können. Es wurde gezeigt, dass sich die Zellzahlen von P. aeruginosa im Sputum nicht signifikant ändern, wenn sie bei 1 h, 24 h oder 48 h verarbeitet werden, wenn sie bei 4 °C gelagert werden, obwohl die Bakterienzellzahl bei 25 °C für 24…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Cystic Fibrosis Foundation, die diese Forschung finanziert hat, und MedImmune für die großzügige Spende von Anti-Psl0096-Antikörpern. Für diese Studie wurde die Bildgebung an der CAMiLoD-Bildgebungseinrichtung der University of Toronto durchgeführt.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
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