Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique
Summary
Ce protocole fournit des méthodes de visualisation des cellules bactériennes et du polysaccharide du locus de synthèse des polysaccharides (Psl) dans les expectorations des patients atteints de fibrose kystique.
Abstract
La détection précoce et l’éradication de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des patients atteints de fibrose kystique peuvent réduire le risque de développer une infection chronique. Le développement d’infections chroniques à P. aeruginosa est associé à un déclin de la fonction pulmonaire et à une augmentation de la morbidité. Par conséquent, il y a un grand intérêt à élucider les raisons de l’échec de l’éradication de P. aeruginosa par l’antibiothérapie qui se produit chez environ 10 à 40% des patients pédiatriques. L’un des nombreux facteurs qui peuvent influer sur la clairance de l’hôte de P. aeruginosa et la sensibilité aux antibiotiques est les variations de l’organisation spatiale (comme l’agrégation ou la formation de biofilm) et la production de polysaccharides. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à visualiser les caractéristiques in situ de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Une technique d’élimination des tissus a été appliquée aux échantillons d’expectorations après avoir intégré les échantillons dans une matrice d’hydrogel afin de conserver les structures 3D relatives aux cellules hôtes. Après le nettoyage des tissus, des étiquettes fluorescentes et des colorants ont été ajoutés pour permettre la visualisation. L’hybridation in situ par fluorescence a été réalisée pour la visualisation des cellules bactériennes, la liaison d’anticorps anti-Psl marqués par fluorescence pour la visualisation de l’exopolysaccharide et la coloration DAPI à la coloration des cellules hôtes afin d’obtenir des informations structurelles. Ces méthodes ont permis d’obtenir une imagerie à haute résolution de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose par microscopie confocale à balayage laser.
Introduction
Dans cette étude, des expériences ont été conçues pour visualiser la structure in vivo de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients pédiatriques atteints de fibrose kystique (FK). Les infections à P. aeruginosa deviennent chroniques chez 30 à 40 % de la population pédiatrique atteinte de mucoviscidose ; Une fois que les infections chroniques se sont établies, il est presque impossible de les éliminer1. Les isolats de P. aeruginosa provenant de patients atteints d’une infection précoce sont généralement plus sensibles aux antimicrobiens, par conséquent, ceux-ci sont traités avec des antibiotiques anti-pseudomonaux pour prévenir l’établissement d’une infection chronique2. Malheureusement, tous les isolats de P. aeruginosa ne sont pas efficacement éliminés des poumons après une antibiothérapie. Les mécanismes précis associés à l’échec des antibiotiques n’ont pas été entièrement élucidés. Des études antérieures ont montré que les variations de la densité cellulaire du biofilm, de l’agrégation et de la production de polysaccharides peuvent affecter l’efficacité des antibiotiques3. P. aeruginosa produit trois polysaccharides extracellulaires : Pel, Psl et alginate4. La plupart des souches de P. aeruginosa ont la capacité génétique d’exprimer chacun des exopolysaccharides, bien que souvent un type de polysaccharide soit exprimé principalement5. L’exopolysaccharide alginate est associé à des infections chroniques dans le poumon de la mucoviscidose, ce qui entraîne un phénotype mucoïde 6,7. Les polysaccharides Pel et Psl ont de multiples fonctions, notamment l’aide à la fixation initiale et au maintien de la structure du biofilm, et l’octroi d’une résistance aux antibiotiques8.
Des méthodes visant à visualiser les structures in vivo des tissus ont été développées pour une variété de types d’échantillons 9,10,11. Plus récemment, ils ont été adaptés pour visualiser in vivo les communautés microbiennes dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose12. L’optimisation d’un protocole de nettoyage tissulaire spécifiquement pour l’identification des communautés microbiennes dans les expectorations a été développée par DePas et al., 201612. Le terme MiPACT, qui signifie identification médicaleaprès la t echnique CLARITY Passive, a été inventé pour l’élimination des expectorations de la mucoviscidose11,12. Pour les techniques de nettoyage des tissus, les échantillons sont d’abord fixés, puis rendus transparents tout en laissant leur architecture inhérente intacte pour la coloration et la visualisation microscopique11. La fixation et l’élimination des échantillons d’expectorations de mucoviscidose permettent aux chercheurs de répondre à des questions liées à la structure du biofilm, à la densité cellulaire bactérienne, aux associations polymicrobiennes et aux associations entre les agents pathogènes et les cellules hôtes. L’avantage d’examiner directement les bactéries qui ont été préservées dans les expectorations est qu’elles peuvent être analysées et visualisées dans un contexte spécifique à l’hôte. Bien que la croissance in vitro d’isolats cliniques en laboratoire à des fins d’expérimentation puisse être très instructive, de telles méthodes ne sont pas en mesure de recréer complètement l’environnement pulmonaire de la mucoviscidose, ce qui entraîne un décalage entre les résultats de laboratoire et les résultats pour les patients.
Les méthodes présentées ici peuvent être utilisées pour réparer et éliminer les expectorations afin de visualiser les bactéries, qu’elles proviennent de patients atteints de mucoviscidose ou de patients atteints d’autres infections respiratoires. Le type spécifique de coloration et d’analyse microscopique décrit ici est l’hybridation in situ par fluorescence (FISH), suivie d’une liaison anti-anticorps Psl dans l’hydrogel, et d’une analyse ultérieure par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Après le nettoyage des tissus, d’autres méthodes d’immunohistochimie et de microscopie peuvent également être appliquées.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de ce protocole est de permettre d’avoir un aperçu de l’organisation in situ des cellules de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les échantillons d’expectorations doivent être conservés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités s’ils ne peuvent pas être fixés immédiatement. Il a été démontré que le nombre de cellules de P. aeruginosa dans les expectorations ne change pas de manière significative s’il est traité à 1 h, 24…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier la Fondation de la fibrose kystique qui a financé cette recherche et MedImmune pour leur généreux don d’anticorps anti-Psl0096. Dans le cadre de cette étude, l’imagerie a été réalisée au centre d’imagerie CAMiLoD de l’Université de Toronto.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
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