Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

La guarigione cutanea delle ferite è un processo biologico complesso con fasi di sovrapposizione sequenziale. Richiede la coordinazione di processi cellulari e molecolari che sono regolati in modo temporale e spaziale al fine di ripristinare la funzione barriera dell’epitelio danneggiato. Nella prima fase, infiammazione, neutrofili e macrofagi migrano nella ferita, mobilitando difese locali e sistemiche¹. Seguire e sovrapporre la fase infiammatoria è la fase di proliferazione. I fibroblasti iniziano rapidamente a prolifere e migrare nel tessuto di granulazione. I cheratinociti lontano dal bordo d’attacco proliferano direzionale verso la ferita mentre i cheratinociti differenziati nel bordo anteriore migrano per er epitelializzare la^{ferita 2}. Infine, inizia la fase di rimodellamento e maturazione, durante la quale i fibroblasti nel tessuto di granulazione iniziano a sintetizzare e depositare collagene. Il rimodellamento e l’organizzazione della nuova matrice possono durare fino a 1 anno dopo l’infortunio³. A causa della complessità degli eventi sovrapposti che coinvolgono il cross-talk tra più tipi di cellule, e nonostante anni di ricerca, molti dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della guarigione delle ferite rimangono poco compresi.

Il modello di topo è il modello di mammifero predominante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite a causa della loro facilità d’uso, costo relativamente basso e manipolabilità genetica^1,4,5. Sebbene diversi tipi di ferite siano stati descritti nel modello murino, il più comune è una ferita adicisionale (pugno bilaterale o biopsia a pugno diretto), seguita da modelli di ferita incisiva⁴. Il modello di ferita adicizionale ha un netto vantaggio rispetto al modello incisivo in quanto genera intrinsecamente tessuto di controllo che non ha subito il processo di guarigione. Il tessuto di biopsia del punzone che viene asportato come parte del protocollo chirurgico può essere elaborato allo stesso modo del tessuto ferito e utilizzato per stabilire le condizioni omeostatiche per un criterio desiderato. Il tessuto di controllo delle accise può anche essere utile se si valutano gli effetti di un pretrattamento cutaneo o si conferma un’alterazione genica riuscita al momento della^{lesione 4}.

I parametri di guarigione possono essere valutati con molte tecniche diverse, tra cui planimetria o istologia. Tuttavia, la planimetria può solo valutare le caratteristiche visibili della ferita, e a causa della presenza di una crosta, spesso non è correlata a misurazioni di guarigione che vengono visualizzate dall’istologia, rendendo così l’istologia il “gold standard” dell’analisi⁴. Nonostante l’analisi istologica sia il gold standard, viene spesso eseguita su un sottoinsieme arbitrario della ferita^6,7. Ad esempio, tagliare la ferita a “metà” prima di incorporare e sessare la ferita è attualmente una pratica comune per ridurre il tempo e le risorse spesi per sezionamento dei materiali e analisi dei dati. Il metodo di analisi morfometrica descritto in questo protocollo è stato sviluppato per comprendere l’intero tessuto della ferita, per riflettere accuratamente le caratteristiche morfologiche della ferita e per aumentare la probabilità di rilevare difetti di guarigione delle ferite con una piccola dimensione dell’effetto. In questo protocollo, dettagliamo un metodo chirurgico per generare la ferita murina più comunemente studiata, la ferita incisiva bilaterale a pieno spessore, nonché un metodo dettagliato e rigoroso per l’analisi istologica che viene usato raramente sul campo.