A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Carlemi Calitz; Nata&#353;a Pavlovi&#263;; Jenny Rosenquist; Claudia Zagami; Ayan Samanta; Femke Heindryckx

doi:10.3791/61606

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Ricerca sul cancro

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Published: August 07, 2020

doi:

10.3791/61606

Carlemi Calitz¹, Nataša Pavlović¹, Jenny Rosenquist², Claudia Zagami¹, Ayan Samanta², Femke Heindryckx¹

¹Department of Medical Cell Biology,Uppsala University, ²Polymer Chemistry, Department of Chemistry-Ångström Laboratory,Uppsala University

Summary

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Abstract

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist ein primärer Lebertumor, der sich im Gefolge einer chronischen Lebererkrankung entwickelt. Chronische Lebererkrankungen und Entzündungen führen zu einer fibrotischen Umgebung, die die Hepatocarcinogenese aktiv unterstützt und antreibt. Einsicht in die Hepatokarzinogenese im Hinblick auf das Zusammenspiel von Tumorstroma-Mikro-Umgebung und Tumorzellen ist daher von erheblicher Bedeutung. Dreidimensionale (3D) Zellkulturmodelle werden als fehlendes Bindeglied zwischen aktuellen in vitro 2D-Zellkulturmodellen und in vivo-Tiermodellen vorgeschlagen. Unser Ziel war es, ein neuartiges 3D-biomimetisches HCC-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach und Vaskulatur zu entwerfen. Physiologisch relevante Hydrogele wie Kollagen und Fibrinogen wurden eingebaut, um die biophysikalischen Eigenschaften des Tumors ECM nachzuahmen. In diesem Modell wurden LX2- und HepG2-Zellen, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind, auf den invertierten Transmembraneinsatz gesetzt. HUVEC-Zellen wurden dann auf die gegenüberliegende Seite der Membran gesät. Drei Formulierungen, bestehend aus ECM-Hydrogelen, die mit Zellen eingebettet sind, wurden hergestellt und die biophysikalischen Eigenschaften wurden durch Rheologie bestimmt. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen Zelllebensfähigkeitstest über 21 Tage bestimmt. Die Wirkung des Chemotherapeutikums Doxorubicin wurde sowohl in der 2D-Kokultur als auch in unserem 3D-Modell für einen Zeitraum von 72h bewertet. Rheologie-Ergebnisse zeigen, dass biophysikalische Eigenschaften einer fibrotischen, zirrhose und HCC-Leber erfolgreich nachgeahmt werden können. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass dieses 3D-Modell repräsentativer für die In-vivo-Situation im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen ist. Unser 3D-Tumormodell zeigte eine verminderte Reaktion auf Chemotherapeutika und imitierte die Arzneimittelresistenz, die typischerweise bei HCC-Patienten zu beobachten ist.

Introduction

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) umfasst 90% aller primären Leberkrebserkrankungen¹^,². Mit 810.000 Todesfällen und 854.000 neu gemeldeten Fällen pro Jahr ist es derzeit die fünfthäufigste Krebsart weltweit mit einer der höchsten Inzidenzen von Sterblichkeit¹. Die Entwicklung von HCC wird hauptsächlich auf Entzündungen im Zusammenhang mit chronischen Lebererkrankungen zurückgeführt, nämlich virale Hepatitis, chronischer übermäßiger Alkoholkonsum, metabolisches Syndrom, Fettleibigkeit und Diabetes¹^,³^,⁴. Die Entzündung im Zusammenhang mit diesen pathologischen Bedingungen führt zu Hepatozytenverletzungen und Sekretion verschiedener Zytokine, die hepatische stellate Zellen und entzündliche Zellen aktivieren und rekrutieren, um Fibrose zu initiieren⁵. Hepatische stellate Zellen sind für ihre Schlüsselrolle bei der Initiierung, Progression und Regression der Leberfibrose bekannt. Bei aktivierung differenzieren sie sich in Myofibroblasten wie Zellen mit kontraktilen, pro-inflammatorischen und pro-fibrinogenen Eigenschaften⁶^,⁷^,⁸. Die daraus resultierende Fibrose wiederum verursacht die Dysregulation der extrazellulären Matrix-Remodeling-Enzymaktivität, wodurch eine Umgebung entsteht, die durch eine insgesamt erhöhte Steifigkeit gekennzeichnet ist, die von der Sekretion von Wachstumsfaktoren begleitet wird, die weiter zur HCC-Pathogenese⁹^,¹⁰beiträgt. Es ist diese kontinuierliche pathogene Rückkopplungsschleife zwischen Hepatozyten und der stromalen Umgebung, die die Krebsinitiierung, epitheliale zu mesenchymalen Übergängen (EMT), Angiogenese, metastasierendem Potenzial und veränderter Arzneimittelreaktion¹¹^,¹²^,¹³antreibt. Einblicke in die Hepatokarzinogenese im Hinblick auf das Zusammenspiel von Tumor und Tumormikro-Umgebung sind daher nicht nur aus mechanistischer, sondern auch aus Behandlungssicht von erheblicher Bedeutung.

Zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle werden überwiegend von 80% der Krebszellbiologen¹⁴verwendet. Diese Modelle sind jedoch nicht repräsentativ für die wahre Tumor-Mikro-Umgebung, die chemotherapeutische Reaktionen betrifft¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Derzeit scheitern 96% der Chemotherapeutika in klinischen Studien¹⁴. Diese hohe Inzidenz von Medikamentenzermürbungsraten ist darauf zurückzuführen, dass verfügbare In-vitro-Vorscreening-Modelle unsere aktuelle Einsicht und unser Verständnis der HCC-Komplexität und der Mikroumgebung nicht vollständig repräsentieren¹⁶. Umgekehrt in vivo Tiermodelle mit geschwächtem Immunsystem und Diskrepanzen in Wechselwirkungen zwischen dem Tumor und der Mikroumgebung im Vergleich zu Menschen¹⁶^,¹⁷. Im Durchschnitt können nur 8 % der Ergebnisse aus Tierstudien zuverlässig aus dem präklinischen in den klinischen Rahmen¹⁶^,¹⁷übersetzt werden. Daher ist es klar, dass die Bewertung von HCC die Entwicklung einer In-vitro-Plattform erfordert, die die Komplexität nicht nur des Tumors, sondern auch der Mikroumgebung effektiv rekapituliert. Die Plattformen würden die derzeit verfügbaren vorklinischen Screening-Modelle in vitro ergänzen und die Anzahl der Tierstudien in Zukunft reduzieren⁷^,¹⁴.

Eine solche Plattform sind fortschrittliche dreidimensionale (3D) Zellkulturmodelle. Eine Vielzahl dieser fortschrittlichen 3D-Modelle zur Untersuchung von HCC sind in den letzten zehn Jahren entstanden und verschiedene Bewertungen wurden veröffentlicht. Verfügbare 3D-Modelle zur Untersuchung von HCC umfassen mehrzellige Sphäroide, Organoide, Gerüstmodelle, Hydrogele, Mikrofluidik und Biodruck. Davon sind mehrzellige Sphäroide eines der bekanntesten Modelle, die bei der Untersuchung der Tumorentwicklung verwendet werden. Sphäroide sind ein preiswertes Modell mit geringem technischen Schwierigkeitsgrad und imitieren gleichzeitig effektiv in vivo Tumorarchitektur¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Mehrzellige Sphäroide haben zu einer Fülle von Informationen über HCC¹⁷^,²¹^,²²beigetragen. Es fehlt jedoch an standardisierter Kulturzeit, da mehrzellige Sphäroide zwischen 7 und 48 Tagen in der Kultur gehalten werden. Die Zeit der Kultur ist von erheblicher Bedeutung. Eilenberger fand heraus, dass die Unterschiede im Sphäroidalter Die Diffusivität und Toxizität von Sorafenib (ein Kinase-Hemmer zur Behandlung von Leberkrebs) tiefgreifend^{beeinflussen.} Während Wrzesinski und Fey fanden, dass 3D Hepatozyten sphäroide 18 Tage benötigen, um wichtige physiologische Leberfunktionen nach der Trypsinisierung wiederherzustellen und weiterhin die stabile Funktionalität für bis zu 24 Tage nach dieser Erholung²⁴^,²⁵.

Einige der fortschrittlicheren 3D-HCC-Modelle umfassen die Verwendung von menschlichen dezellularisierten Lebergerüsten und biogedruckten Gerüsten. Mazza und Kollegen erstellten ein natürliches 3D-Gerüst für die HCC-Modellierung mit dezellularisierten menschlichen Lebern, die nicht für die Transplantation geeignet^{sind 26}. Diese natürlichen Gerüste konnten erfolgreich für 21 Tage mit einer Kokultur von Leberstellat- und Hepatoblastomzellen wieder aufgefüllt werden, während die Expression wichtiger extrazellulärer Matrixkomponenten wie Kollagen Typ I, III, IV und Fibronectin beibehalten wurde. Abgesehen von der Krankheitsmodellierung bietet dieses Modell auch den Vorteil der funktionellen Organtransplantation und des präklinischen Arzneimittel- und Toxizitätsscreenings²⁶. Mit den Fortschritten im 3D-Biodruck können nun auch extrazelluläre Matrixgerüste biogedruckt werden. Ma und Kollegen, biogedruckte extrazelluläre Matrixgerüste mit variablen mechanischen Eigenschaften und biomimetische Mikroarchitektur mit Hydrogels Engineer aus dezellulisierter extrazellulärer Matrix²⁷. Zweifellos sind dies alles ausgezeichnete 3D HCC Modelle. Die Nichtverfügbarkeit menschlicher Lebern und die Kosten für den Erwerb der notwendigen Ausrüstung und Materialien benachteiligen diese Modelle jedoch. Darüber hinaus sind diese Methoden alle technisch fortgeschritten und erfordern eine umfassende Ausbildung, die möglicherweise nicht allen Forschern zur Verfügung steht.

Basierend auf der Komplexität von HCC und derzeit verfügbaren 3D-Modellen haben wir uns bemüht, ein umfassendes 3D-HCC-Modell zu entwickeln. Wir strebten ein Modell an, das sowohl die prämaligne als auch die Tumormikroumgebung rekapitulieren kann, indem wir einstellbare Hydrogelsteifigkeitswerte einbauen. Darüber hinaus haben wir auch hepatozelluläre und stromaassoziierte Zelllinien aufgenommen, die eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von HCC spielen. Dazu gehören Endothelzellen, hepatische Stellatzellen und bösartige Hepatozyten, die in einer Mikroumgebung aus physiologisch relevanten Hydrogelen angebaut werden. Mit den gewählten Hydrogelen, Kollagen Typ I und Fibrinogen, in Verhältnissen vergleichbar mit bio-physikalischen Veränderungen in der Lebersteifigkeit während der Einleitung und Progression von HCC gesehen. Darüber hinaus strebten wir ein Modell an, das über einen längeren Zeitraum in der Kultur gehalten werden könnte. Wir stellten uns ein modulares, kostengünstiges Modell vor, das mit Grundausstattung, minimaler Schulung und Erfahrung und leicht verfügbaren Materialien eingerichtet werden kann.

Protocol

Abbildung 1: Grafische Darstellungen der Erstellung des 3D-biomimetischen HCC-Modells Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. ANMERKUNG: Der gesamte Workflow dieses Protokolls ist in den Abbildungen von Abbildung 1 1. Herstellung von Fibrinogen-Stammlösung Bereiten Sie eine 1 M Calciumchlorid (CaCl2) Stofflösung vor, indem Sie 2,21 g CaCl2 wiegen und zu 20 ml destilliertem Wasser (dH2 O)hinzufügen. Die Lagerlösung kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden. Bereiten Sie eine 20 ml Aprotinin-Lagerlösung (1218,75 KIU/ml) vor, indem Sie 5 mg Aprotinin wiegen und zu 20 mldH2O. Aliquot-Lagerlösung in 1 ml Aliquot-Lageraufsatz aufbewahren und bei -20 °C lagern. Bereiten Sie eine 10 ml von 80 mg/ml Fibrinogen-Stammlösung vor. In einem 50 ml-Rohr 7,849 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS), 2.051 ml Aprotininbestand (1218,75 KIU/ml) für eine endgültige Aprotininkonzentration von 250 KIU/ml und 100 l CaCl2 (1M) für eine endgültige CaCl2-Konzentration von 10 mM hinzufügen. Wiegen Sie 800 mg Fibrinogen. Wiegen Sie 200 mg Natriumchlorid (NaCl) für die Stammlösung mit 2% w/v NaCl. Fügen Sie das Fibrinogen und NaCl in Schritten in das 50 ml-Rohr, das DIE PBS, Aprotinin und CaCl2enthält. Nicht kräftig rühren oder schütteln, da dies zu fibrinogener Gelierung und Klumpenbildung in der Lösung führt. Das 50 ml-Rohr der Fibrinogen-Stammlösung horizontal auf einen Shaker legen und bei einer niedrigen Einstellung von 300 U/min schütteln. Sobald sich die Lösung gelöst hat, filtern Sie sie je nach Volumen mit einem Spritzenfilter oder einem Flaschentopfilter. Wichtig ist, autoklavieren Sie nicht die Fibrinogen-Lösung, da dies das Fibrinogen zerstören wird.HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann je nach Menge der Lagerlösung zwischen 2 und 5 h dauern, diese Zeit sollte während des Versuchsaufbaus berücksichtigt werden. 2. Beschichtungseinsätze mit Kollagen vor der Aussaat der Hydrogele auf die Einsätze In einer laminaren Strömungshaube oder einer Gewebekulturhaube, mit sterilisierter Pinzette, entfernen Sie Einsätze von der Platte und legen Sie invertiert auf den Deckel der Platte. Bereiten Sie eine 100 ml 20 mM Eisessig-Lagerlösung vor, indem Sie 115 l Eisessigsäure zu 25 ml dH2O hinzufügen und sich auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH2O einstellen. Filtern Sie die Lösung mit einem Spritzenfilter von 0,22 m. Lagerlösung kann bei RT gelagert werden. Bereiten Sie 2 ml einer Kollagenlösung mit 100 g/ml aus einer 5 mg/ml Kollagenlösung vor, indem Sie 40 l der 5 mg/ml Kollagenlösung zu 1,960 ml der 20 mM Eisassigsäure-Stammlösung, die in 2.2 hergestellt wird, hinzufügen. Beschichten Sie die Einsätze mit der in 2,3 hergestellten Kollagenlösung von 100 g/ml, indem Sie 100 l der Lösung auf jeden Einsatz pipetieren. Lassen Sie die Luft in der laminaren Strömungshaube oder Gewebekulturhaube für 2 bis 3 h trocknen. Sobald die Einsätze getrocknet haben, waschen Sie jeden Einsatz 3x mit PBS. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Brunnen einer 12 Wellplatte hinzu, legen Sie die Einsätze mit Kollagenbeschichtung nach unten in die Brunnen, entfernen PbS aus dem Brunnen und wiederholen Sie den Vorgang. Lassen Sie die Luft trocken in die laminare Strömungshaube 1 bis 2 h.VORSICHT: Essigsäure ist toxisch für Zellen und Einsätze sollten gründlich mit PBS gewaschen werden. Fügen Sie einen benutzerdefinierten 3D-gedruckten Abstandhalter über die Einsätze, wird dies notwendig sein, sobald die Gele hängen von der Einlage, um zu verhindern, dass sie die untere Bohrung der Platte berühren(Abbildung 2). Abbildung 2: Benutzerdefinierter 3D-gedruckter Abstandsraum Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Bedecken Sie die invertierten Einsätze mit dem unteren Teil der Platte und legen Sie sie in den Inkubator, bis die Zellen in die Hydrogele eingebettet sind und zur Aussaat bereit sind. 3. In Hydrogele eingebettete Saatzellen auf Einsätze ANMERKUNG: Tabelle 1 enthält eine Beschreibung von 3 Formulierungen mit unterschiedlichen Konzentrationen fibrinogen, die vorbereitet werden. Formulierung eins entspricht der Leber während des Beginns der Fibrose, zwei Zirrhose und drei HCC, die Steifigkeitswerte für jede dieser Formulierungen wurden mit Rheologie während der Protokolloptimierung bestimmt. Formulierung Endgültige Fibrinogenkonzentration (mg/ml) Endgültige Kollagenkonzentration (mg/ml) Zellen (LX2 + HepG2 Co-Culture 1:1) Stadium der Leber Literatur Lebersteifigkeitswerte (kPa) Modellsteifigkeitswert aus Rheologie (kPa) Formulierung Fibrinogen hinzuzufügen (mL) Kollagen zum Hinzufügen (mL) 10 % DMEM (mL) Thrombin (L) Referenzs 1 10 2 2 x 106 Zellen/ml Fibrose ≥2 3 1 1 0.8 0.2 4 28; 29; 30 2 30 2 2 x 106 Zellen/ml Zirrhose 6 2 0.75 0.8 0.45 3 3 40 2 2 x 106 Zellen/ml Hcc 10 ≥ 10 3 0.25 0.8 0.95 1 28; 31; 32 Tabelle 1: Beschreibung von Formulierungen für Säzellen, die in Hydrogele auf Inserts eingebettet sind Bereiten Sie 1 M Natriumhydroxid-Stammlösung vor, indem Sie 3,99 g NaOH zu 100 ml dH2O hinzufügen. Die Lösung kann dann mit einem 0,22 m Spritzenfilter gefiltert werden. Bewahren Sie die Lagerlösung bei RT auf. 5 mg/ml Kollagen und 10 ml 1 M NaOH auf Eis legen. 50 ml PBS, 15 ml Trypsin, 70 ml 10% DMEM und Fibrinogen-Stammlösung, in Abschnitt 1, auf 37 °C für 20 min in einem Wasserbad vorheizen. Bereiten Sie die Zellsuspensionen vor. Waschen Sie leberstellate Zellen (LX2) und Leberkarzinom (HepG2) Zellen in T175-Kulturkolben zweimal mit 10 ml PBS. Trypsinize-Zellen mit 6 ml Trypsin für 4 min bei 37 °C. Inaktivieren Sie Trypsin mit 6 ml von 10% DMEM. Sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml Rohr und Zentrifuge für 3 min bei 300 x g. Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen und jede Zelllinie in 5 ml 10% DMEM wieder aufsetzen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler: Fügen Sie 10 L jeder Zellsuspension zum Zählkammerschlitten hinzu, und legen Sie das Dia in den Zellzähler ein. Die Zellanzahl wird als Zellen/ml angezeigt. Verdünnen Sie die Zellen aus jeder Zelllinie auf 1 x 106 Zellen pro ml mit der Zellzahl in Schritt 3.4.6 in deutlich markierte 15 ml-Röhren. Zentrifugieren Sie die Verdünnungen für 3 min bei 300 x g. Nach der Zentrifugation, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 10% DMEM zu jedem 15 ml Rohr nach Tabelle 1, Werte in der Tabelle angegeben ist für 2 ml jeder Formulierung. Neutralisieren Sie die Menge an Kollagen mit 10 L/ml NaOH (1 M), und fügen Sie das neutralisierte Kollagen zur Zellsuspension hinzu, das 10% DMEM-Geschenk wird gelb, sobald die Suspension gründlich durch Pipettieren mit einer Schnittspitze gemischt wird, wird es ein helles Rosa drehen. Fügen Sie Fibrinogen in die Kollagenzellsuspension nach Tabelle 1, mit einer geschnittenen Pipettenspitze, mischen Sie die Suspension gründlich. Fügen Sie Thrombin schließlich zu Kollagen-Fibrinogen-Zellsuspension, 0,1 KIU Thrombin für jede 10 mg Fibrinogen. Entfernen Sie die in Abschnitt 2 hergestellten vorbeschichteten invertierten Einsätze aus dem Inkubator und verwenden Sie eine geschnittene 200-L-Pipettenspitze, Pipette 200 l der vorbereiteten Suspension auf die vorgesehenen Einsätze. Lassen Sie die Gele für 15 min innerhalb der laminaren Strömungshaube vernetzen. Nach 15 min den unteren Teil der Platte vorsichtig über die Gele legen und zum Inkubator bewegen, damit sich die Gele 45 min bei 37 °C vernetzen können. Sobald die Gele vernetzt sind, invertieren Sie die Einsätze erneut und fügen Sie 2 ml 10% DMEM zu jeder der unteren Brunnen der Platte hinzu. 4. Aussaat endotheliale Zellen 25 ml hanks balanced salt solution (HBSS), 10 ml Trypsin, 10 ml Trypsin-Inhibitor und 50 ml endotheliale Wachstumsmedium vorheizen, auf 37°C für 20 min in einem Wasserbad. Bereiten Sie die endotheliale (HUVEC) Zellsuspension vor. HUVEC-Zellen in T175-Kulturkolben zweimal mit 10 ml HBSS waschen. Trypsinize-Zellen mit 6 ml Trypsin für 4 min bei 37 °C. Inaktivieren Sie Trypsin mit 6 ml Trypsin-Inhibitor. Sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml Rohr und Zentrifuge für 3 min bei 200 x g. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und suspendieren die Zellen in 5 ml endothelialem Wachstumsmedium. Zählen Sie die Zellen wie zuvor in 3.4.6 beschrieben mit einem automatisierten Zellzähler. Mit der Zellzahl aus dem Zellzähler die Saatdichte von 1,0 x 104 Zellen/ml im endothelialen Wachstumsmedium vorzubereiten. Samen 500 l der HUVEC-Zellsuspension in jede Bohrung des oberen Teils des Inserts, um ein Endvolumen von 5,0 x 103 Zellen pro Einsatz zu haben. 5. Wartung Ersetzen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag, Aspirat verbrachte Wachstumsmedium sowohl aus dem Brunnen und der Einsatz. Fügen Sie den Brunnen, die das Gel enthalten, und 0,5 ml endothelialem Wachstumsmedium 2 ml 10 % DMEM zu den Einsätzen hinzu, die die HUVEC-Zellen enthalten. Bewahren Sie das Modell 21 Tage vor dem Experimentieren auf. 6. Rheologie Messen Sie die Speichermoduli von Gelformulierungen, um Steifigkeitswerte mit einem Rheometer anzuzeigen, indem Sie Frequenzsweeps von 0,1-20 Hz bei 0,267 % und 37 °C durchführen, mit einer konstanten Axialkraft von 0,1N unter Verwendung einer parallelen Edelstahlgeometrie mit einem Durchmesser von 8 mm. 7. Lebensfähigkeit und Arzneimittelreaktion Bestimmen Sie die Wirkstoffreaktion und Lebensfähigkeit in 2D-Kokulturen und 3D-Modell. Saat-HepG2-Zellen (5,0 x 103 Zellen/ml) und LX2 (5,0 x 103 Zellen/ml) Zellen im Verhältnis 1:1 für die 2D-Kokultur in eine schwarze klare untere 96-Well-Platten bei einer Sädichte von 1,0 x 104 Zellen/ml. Lassen Sie Zellen über Nacht anheften. Richten Sie das 3D-Modell so ein, dass es einer zirrhotischen Umgebung mit einem Steifigkeitswert von 6 kPa entspricht. Halten Sie das Modell 21 Tage vor der Behandlung mit Doxorubicin aufrecht. Zwei Stunden vor der Doxorubicin-Behandlung, aspirieren Sie das Kulturmedium aus dem 2D- und 3D-Modell. Waschen Sie beide Modelle zweimal mit PBS. Fügen Sie das Hungermedium (DMEM ergänzt durch 1% v/v Antimykotikanti-Lösung) in die 2D-Kokultur (200 l pro Brunnen) und zum 3D-Modell (2 ml zu den Brunnen, die das Hydrogel enthalten, und 500 l zum Einsatz) hinzu. Doxorubicin sowohl dem 2D- als auch dem 3D-Modell andiebe. Dosierungen sind wie folgt: 0,5, 1 und 1,5 mM entsprechend den IC25-, 50- bzw. 75-Werten. Behandeln Sie beide Modelle für 72 h.HINWEIS: Doxorubicin, ein Topoisomerase-II-Hemmer, ist eines der ersten Chemotherapeutikums, das für HCC verwendet wird, und ist auch eines der aktivsten Chemotherapeutika bei der Behandlung von HCC33,34. Nach 72 h, angesaugt Kulturmedium aus dem 2D-und 3D-Modell. Stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Kulturmedien entfernt werden, indem Sie beide Modelle zweimal mit PBS waschen. Bereiten Sie AlamarBlue gemäß den Herstellerempfehlungen vor und fügen Sie die Brunnen des 2D- und 3D-Modells hinzu. Fügen Sie 150 l pro Brunnen für die 2D-Kultur und 2 ml pro Brunnen und 500 l pro Einsatz für 3D-Kultur hinzu. Über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationsübertragung 150 l des AlamarBlue aus jedem Brunnen des 3D-Setups in eine schwarze, klare 96-Well-Platte. AlamarBlue kann direkt von der Platte für das 2D-Modell abgelesen werden. Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser bei Anregungswellenlänge und Emissionswellenlänge von 485 bzw. 550 nm. Berechnen Sie die prozentuale Zelllebensfähigkeit in beiden Modellen mit der folgenden Formel:

Representative Results

Konzentrationsbereiche und SävolumenDie Protokolloptimierung zur Erlangung des endgültigen Funktionsprotokolls erfolgte gemäß dem in Abbildung 3dargestellten Schemadiagramm. Zwei physiologisch relevante Hydrogele, Kollagen Typ I und Fibrinogen, wurden mittels einer Literaturrecherche35,36identifiziert. Beginnend mit Rattenschwanzkollagen Typ I wurde eine Reihe von Konzentrationen (4, 3, 2 und 1 mg/ml) auf invertierte Einsätze gesetzt, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, erfolgreich an der Einlage zu haften, sobald sie wieder umgekehrt sind. Alle Konzentrationen innerhalb dieses Bereichs waren in der Lage, Gele zu bilden, aber Kollagengele erschienen abgeflacht und hatten verschiedene Luftblasen in sich gefangen wegen Handhabung und Pipettierung, siehe Abbildung 4 und Abbildung 5. Um das optimale Saatvolumen zur Verbesserung der Qualität des Kollagengels zu bestimmen, wurde eine Reihe von Sävolumina (100, 150 und 200 l) auf invertierte Einsätze gesetzt, siehe Abbildung 5. Das Sävolumen hatte keinen Einfluss auf das Aussehen des Gels oder das Vorhandensein von Blasen im Gel. Dementsprechend wurde entschieden, dass 200 l das optimale Sävolumen sind, das die vollsten Gele produziert. Fibrinogen wurde auch für seine Fähigkeit bewertet, ein Gel zu produzieren, das über einen längeren Zeitraum an einem Einsatz haften könnte. Ein Konzentrationsbereich (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 mg/ml) wurde hergestellt und mit einem Volumen von 200 l auf den Deckel einer 12-Well-Platte gesät, siehe Abbildung 6. Innerhalb von 20 min nach der Aussaat konnten alle Konzentrationen erfolgreich ein Gel bilden. Die Konzentrationen 5 und 1 mg/ml wurden jedoch ausgeschlossen, da die gebildeten Gele eine flüssigkeitsähnliche Konsistenz hatten und begonnen hatten, sich vom Deckel zu lösen, nachdem sie über Nacht bei 37 °C gehalten worden waren. Abbildung 3: Schematisches Diagramm der Protokolloptimierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Kollagengele 4 mg/ml mit 1,0 x 105 Zellen/ml, die auf Inserts gesetzt werden, die Blasen im Gel zeigen. Einsatz auf der linken Seite wurde auf Eis für 15 min entgast, während Einsatz auf der rechten Seite nicht entgast wurde. Die Entgasung hatte keinen Einfluss auf die Blasen in den Gelen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Kollagengele 4 mg/ml mit 1,0 x 105 Zellen/ml, die in unterschiedlichen Mengen auf Einsätze gesetzt werden. (A) Einfügen auf der linken Seite 100 l, Mitte 150 l und rechts 200 l, direkt nach der Aussaat. Blasen in den Gelen waren noch vorhanden. (B) Einfügen auf der linken Seite 200 l, Mitte 150 l und rechts 100 l, nach 60 min Vernetzung. Alle Gele unabhängig von der Lautstärke erscheinen immer noch flach. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Fibrinogen (200 l) in einem Konzentrationsbereich von 70 bis 1 mg/ml, der auf den Deckel einer 12-Well-Platte gesetzt wird. (A) Gele direkt nach der Aussaat. (B) Gele 20 min nach der Aussaat. (C) Gele über Nacht gehalten. Alle Gele erscheinen gut abgerundet, die 5 mg/ml und 1 mg/ml Gele wurden ausgeschlossen, da sie 20 min nach der Aussaat eine flüssigere Konsistenz zu haben schienen und begonnen hatten, sich vom Deckel zu lösen, nachdem sie über Nacht aufbewahrt worden waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Kombination kollagen und FibrinogenBasierend auf den Ergebnissen der Kollagen- und Fibrinogenkonzentrationwurde die Wirkung der Kombination von Kollagen und Fibrinogen bewertet. Drei Einsätze wurden mit dem folgenden, 4 mg/ml Kollagen, 20 mg/ml Fibrinogen und einer Ration von 1:1 Ration kollagen (4 mg/ml) und Fibrinogen (20 mg/ml) eingerichtet, siehe Abbildung 7. Unmittelbar nach der Aussaat der Hydrogele beobachteten wir, dass der Einsatz mit Kollagen allein noch ein flaches Aussehen in Kombination mit dem Auftreten von Blasen im Gel hatte. Die Einsätze mit Fibrinogen erzeugten ein vollständiges und abgerundetes Gel, ebenso wie der Einsatz mit der Kombination von Kollagen und Fibrinogen. Nach einer Kreuzverbindung bei 37 °C für 60 min hatten sich alle Gele am Einsatz befestigt und blieben nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 °C befestigt. Abbildung 7: Wirkung der Kombination von Kollagen und Fibrinogen. (A) Kollagen 4 mg/ml auf der linken Seite ausgesät, Fibrinogen 20 mg/ml auf Einsatz in der Mitte und Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml (1:1 Ration) auf der rechten Seite gesät. Alle Gele, die mit einem Volumen von 200 l mit 1,0 x 105 Zellen/ml gesät wurden, alle Gele waren 60 min bei 37 °C vernetzt. (B) Kollagen 4 mg/ml 60 min nach Vernetzung, Gel erschien flach und hatte Blasen. (C) Einfügen auf dem linken Fibrinogen 20 mg/ml, Gel erscheinen abgerundet, keine Blasen vorhanden, Einsatz auf dem rechten Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml Gel, Gel ist gut abgerundet ohne Blasen. (D) Kollagen 4 mg/ml Gel nach über Nacht bei 37 °C gehalten, Gel enthielt noch eine große Menge an Blasen, einige Schwellungen des Gels ist aufgetreten. (E) Fibrinogen 20 mg/ml über Nacht bei 37 °C gehalten. (F) Kollagen 4 mg/ml, Fibrinogen 20 mg/ml Gel über Nacht bei 37 °C gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Bestimmen der ZellsädichteBasierend auf den bisherigen Erfahrungen mit Hydrogelen wurde ein Experiment zur Bestimmung der optimalen Zellsädichte (daten nicht gezeigt)eingerichtet 37. Die Zellen wurden in eine Kombination von Kollagen und Fibrinogen im folgenden Konzentrationsbereich eingebettet (7,5 x 105, 8,5 x 105, 9,5 x 105, 1,0 x 106, 1,5 x 106 und 2,0 x 106 Zellen/ml), 2,0 x 106 Zellen/ml wurden als optimale Saatdichte gefunden. RheologieZehn Formulierungen der Fibrinogen- und Kollagenhydrogelkombinationen wurden mittels Rheologie bewertet, siehe Tabelle 2. Ziel war es zu bestimmen, welche dieser Formulierungen die Lebersteifigkeit imitieren könnte, die während der Entwicklung von HCC beobachtet wurde. Literatur lieferte bekannte Lebersteifigkeitswerte für Ratten, Mäuse und Menschen während Fibrose, Zirrhose und HCC und das Ziel war es, so nah wie möglich an diese Werte zu kommen28,29,30,31,32. Die zehn Formulierungen gemäß Tabelle 2 wurden in Dreifachform erstellt, und der Speichermodul der einzelnen Formulierungen wurde mit einem Rheometer bestimmt, die Ergebnisse in Abbildung 8dargestellt. Formulierung Fibrinogen (mg/ml) Kollagen (mg/ml) 1 60 2 2 50 2 3 40 2 4 30 2 5 20 2 6 10 2 7 20 5 8 20 4 9 20 3 10 20 1 Tabelle 2: Kollagen- und Fibrinogenkombinationen in verschiedenen Konzentrationen, die mit Rheologie ausgewertet werden, um Steifigkeitswerte zu bestimmen Abbildung 8: Hydrogelsteifigkeitswerte für Kollagen- und Fibrinogenkombinationen in verschiedenen Konzentrationen, die mit Rheologie ausgewertet werden. Speichermodul und Verlustmodul wurden bei 37 °C und 1Hz mittels eines Discovery HR-2 Hybrid Rheometers (n = 3, Fehlerbalken = SD) ermittelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Aus diesen zehn Formeln wurden drei ausgewählt, um mit fortzufahren. Dazu gehörten 2 mg/ml Kollagen Typ I und 10 mg/ml Fibrinogen, die den Lebersteifigkeitswerten bei Beginn der Fibrose entsprachen, 2 mg/ml Kollagen Typ I und 30 mg/ml Fibrinogen entsprechend Zirrhose und 2 mg/ml Kollagen Typ I und 40 mg/ml Fibrinogen entsprechend HCC, siehe Abbildung 9. Abbildung 9: Hydrogelsteifigkeitswerte für verschiedene Fibrinogen/Collagen Hydrogel-Formulierungen, die für die Fortsetzung ausgewählt wurden. Speichermodul und Verlustmodul wurden bei 37 °C und 1 Hz bestimmt (n = 3, Fehlerbalken = SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Lebensfähigkeit, Arzneimittelreaktion und metastasierendes PotenzialDie Ergebnisse des AlamarBlue-Assays zeigten eine insgesamt reduzierte Zelllebensfähigkeit innerhalb der 2D-Kokultur, niedriger als erwartet, basierend auf den bekannten gemeldeten IC 25-, 50- und 75-Werten, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle siehe Abbildung 10. Dies kann auf die LX2-Zellen in unserer Co-Kultur zurückgeführt werden, die empfindlicher auf Doxorubicin-Behandlung sind. In unserem 3D-Modell haben wir jedoch die Doxorubicin-Resistenz festgestellt und erhöht, was die Abnahme des chemotherapeutischen Potenzials bestätigt, das häufig in 3D-Modellsystemen beobachtet wird. Die statistische Signifikanz im Vergleich zu den Kontrollen wurde mit dem Student-T-Test (zweischwanzend) bewertet, wobei P<0,05 als signifikant angesehen wurde. Abbildung 10: Prozentuale Zelllebensfähigkeit eines 2D-Kokulturmodells im Vergleich zum 3D-Modell nach behandlung mit Doxorubicin in verschiedenen Konzentrationen für einen Zeitraum von 72h. Die Ergebnisse normalisiert relativ zum unbehandelten Steuerelement (n=3, Fehlerbalken = SD) (* = p<0.0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Die Gelkonstrukte wurden täglich mit einem Lichtmikroskop visuell untersucht, um das Zellwachstum in verschiedenen Konzentrationen der Hydrogele zu verfolgen. Zellen füllten die Hydrogele homogen und kompakt, ab Tag 7 begannen Sphäroide innerhalb der Matrix zu montieren.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Erstellung eines biomimetischen Modells für HCC. Es wurde ein klarer Workflow eingerichtet und die damit verbundenen kritischen Schritte identifiziert. Zu diesen kritischen Schritten gehören die Herstellung der Fibrinogen-Stammlösung, die Beschichtung der Einsätze mit Kollagen und die Aussaat der in das Hydrogel eingebetteten Zellen. Bei der Herstellung der Fibrinogen-Stammlösung ist es wichtig, das Fibrinogen in kleineren Schritten in höheren Konzentrationen hinzuzufügen. Dies wird nicht nur die Zeit reduzieren, die es für das Fibrinogen benötigt, um sich aufzulösen, sondern auch verhindern, dass das Fibrinogen inkonsistent und vorzeitig gegelt, wie in Abbildung 11zu sehen ist. Die Herstellung des Fibrinogengels nimmt viel Zeit in Anspruch und kann den gesamten experimentellen Erfolg beeinflussen. Ergebnisse zeigen, dass, sobald das Fibrinogen Gel beginnt, inkonsistent zu gelen, ist es am besten, es zu verwerfen. Die Einsätze sollten mit Kollagen beschichtet, mit PBS gewaschen und in der laminaren Strömungshaube getrocknet werden, bevor die in Hydrogele eingebetteten Zellen gesät werden. Wenn nicht sichergestellt wird, dass die Einsätze trocken sind, werden die Hydrogele über die Ränder des Einsatzes auslaufen, was zu einem ungleichmäßigen Gel führt. Ungleichmäßigkeit des Gels wird letztlich die Ergebnisse beeinflussen, bei denen die Diffusion ein Faktor ist.

Abbildung 11: Herstellung von Fibrinogen-Gel für Fibrinogen/Kollagen-Hydrogel-Formulierungen. (A) Fibrinogen-Gellösung, die Klumpen gebildet hat und begann, vorzeitig mit ungelöstem Fibrinogen zu gelieren, das an der Röhre haften. (B) Fibrinogen-Gellösung, die sich vollständig aufgelöst hat, Lösung ist klar und etwas zähflüssiger. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es wird empfohlen, so schnell wie möglich zu arbeiten, während die Hydrogelzellsuspension auf die Einsätze gesetzt wird, da die Fibrinogenkomponente mit der Zugabe von Thrombin zu vernetzen beginnt. Bereiten Sie kleinere Arbeitsvolumina zu einem Zeitpunkt vor, wenn Sie mit Gelsuspensionen in höheren Konzentrationen arbeiten, um zu verhindern, dass das Gel während der Aussaat vernetzt. Letzteres wirkt sich auf die Verteilung und die Menge des auf jeden Brunnen gesäten Gelsausaus aus. Die Reihenfolge des Hinzufügens der Komponenten ist entscheidend, in diesem Protokoll haben wir einen optimierten Workflow bereitgestellt, um zu verhindern, dass Gele vorzeitig vernetzen. Aufgrund der Viskosität der Hydrogelsuspension wird beim Mischen und Messen die Arbeit mit einer geschnittenen Pipettenspitze empfohlen. Beim Mischen der Suspension stellen Sie sicher, dass dies schnell und gleichmäßig erfolgt, um eine homogene Suspension zu erzeugen. Ungleichmäßiges Mischen führt zu einem heterogenen Gel, das sich negativ auf die Ergebnisse auswirkt, siehe Abbildung 12.

Abbildung 12: Kollagen/Fibrinogen-Gele, die auf 12 Brunnenplatten gesät werden. Alle Gele mit einem Volumen von 200 l mit 2mg/ml Kollagen und 20 mg/ml Fibrinogen mit 2,0 x 10⁶Zellen/ml. (A) Hydrogelgel mit heterogener Konsistenz, sichtbare ungleichmäßige Verteilung der Hydrogele. (B) Hydrogele homogen gemischt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Im Anschluss an die Protokolloptimierung wurde das Modell ausgewertet, um die biophysikalischen Eigenschaften der Modelle zu bestimmen. Rheologische Daten zeigten, dass unser Modell, bestehend aus physiologisch relevanten extrazellulären Matrixkomponenten, nämlich Kollagen Typ I und Fibrinogen, in der Lage war, die biophysikalischen Eigenschaften einer fibrotischen, zirritischen und HCC-Leber²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²nachzuahmen. Die Rekapitulation der Lebersteifigkeit in 3D-Modellen für HCC ist von erheblicher Bedeutung und wird bei der Modellentwicklung oft übersehen. Erhöhte Lebersteifigkeit hängt mit Chemotherapeutika Resistenz, Proliferation, Migration, und Ruhe in HCC³⁸. Während die Aktivierung von hepatischen stellaten Zellen in HCC mit erhöhter extrazellulärer Matrixsteifigkeit verbunden ist, mit mehreren Signalwegen, die mit diesen hepatischen stellaten Zellen verbunden sind, die Mechanosensitivität zeigen³⁹.

Die Einbeziehung von stroma assoziierten Zellen wie Leberstellatzellen und Endothelzellen in die Entwicklung von 3D-Modellen für HCC ist zunehmend relevant geworden. Studien zeigen, dass mehrzellige Sphäroide, die aus leberstellaten und HCC-Zellen bestehen, zu einer erhöhten Chemotherapeutikaresistenz und invasiven Migration führten, während sie das Aussehen des HCC-Tumors in vivo imitierten, verglichen mit einem PXT-Mäusemodell und menschlichen HCC-Gewebeproben¹⁷. Eine ähnliche Studie von Jung et al., 2017 fand multizelluläre Sphäroid bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (Huh-7) und endotheliale (HUVEC) Zellen förderte Vaskularisierung und Aggressivität²². Diese Sphäroide zeigten Lebensfähigkeit bei deutlich höheren Konzentrationen von Doxorubicin und Sorafenib im Vergleich zu Huh-7 Monokultursphäroiden²². Die Bewertung der Lebensfähigkeit und Reaktion unseres Modells auf Doxorubicin, mit Steifigkeitswerten, die denen von HCC entsprechen, und der Einbeziehung von stroma assoziierten Zellen (LX2 und HUVEC), zeigte eine ähnliche Geringere Reaktion auf Chemotherapeutika im Vergleich zu einem 2D-Kokulturmodell. So, effektiv imitieren Arzneimittelresistenz in der Regel bei Patienten und anderen 3D-HCC-Modelle gesehen.

Da es sich um ein modulares System handelt, kann das Modell durch die Zugabe weiterer extrazellulärer Matrixkomponenten, nämlich Laminin und Hyaluronsäure, verstärkt werden. Alternativ können die in diesem Modell verwendeten aktuellen Hydrogele durch synthetische Hydrogele wie Natriumalginat oder Chitosan ersetzt werden. Weitere Modifikationen am aktuellen Modell können die Substitution der Zelllinien durch primäre Zellkulturen sein, um ein noch physiologischeres Modell zu erzeugen, oder kombinationen anderer Tumor- und Stromalzelllinien.

So haben wir erfolgreich ein 3D-Modell mit abstimmbaren biophysikalischen Eigenschaften zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in HCC entwickelt. Wir haben festgestellt, dass unser Modell repräsentativer für die In-vivo-Situation im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen als Reaktion auf Doxorubicin ist. Es bleibt jedoch noch viel zu tun, wir hoffen, dieses Modell ausgiebig zu charakterisieren und das Modell als eine mögliche metastasierende Plattform zu erforschen, um komplexere und drängendere Fragen zu beantworten, die in der Studie HCC noch bleiben.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch Stipendien der Schwedischen Krebsstiftung (Cancerfonden, CAN2017/518), der Schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung (SSMF, S17-0092), der O.E. och Edla Johanssons Stiftung und der Olga Jönssons Stiftung finanziert. Diese Finanzierungsquellen waren nicht an der Studiengestaltung beteiligt; Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten; Erstellung des Berichts; und in der Entscheidung, den Artikel zur Veröffentlichung vorzulegen. Der 3D-Druck von kundenspezifischen Abstandshaltern, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurde in der 3D-Druckanlage der Universität Uppsala in der Disziplin-Domäne für Medizin und Pharmazie durchgeführt, U-PRINT@mcb.uu.se. Wir danken Paul O’Callaghan für seinen wertvollen Beitrag zu unserem Projekt.

Materials

AlamarBlue (Resazurin sodium salt)	Sigma	211-500	Prepare according to manufacturesr recommendations
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma	A5955-100ML
Aprotinin Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78432
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-2.5KG	Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0%
CO2 Incubator	Kebo Biomed Sweden
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate	Sigma	CLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports	Sigma	CLS3396-2EA	HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2	TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)	Thermo Fisher Scientific	61965059	Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)	Cell Applications, Inc	211-500
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand	Thermo Fisher Scientific	A3160902
Fibrinogen type I-S from bovine plasma	Sigma	F8630-10G
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
Hanks' balanced salt solution	Sigma	H9394-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate
Labogene scanspeed 416 centrifuge	Labogene, Sweden
Laminar flow hood	Kebo Biomed Sweden
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance	Mettler Toledo
Nikon TMS Light microscope	Nikon, Japan
Phosphate buffered saline tablet	Sigma	P4417-100TAB	Prepare according to manufacturers recommendation
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL	Ibidi	50201
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium Hydroxide (NaOH)	Merck	B619298
TC20 Automated cell counter	BioRad
TC20 cell counter counting slides	BioRad
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)
Trypsin (2.5%) 10x	Thermo Fisher Scientific		Dilute to 1x in PBS
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T6414-100ML	Solution, sterile-filtered

Riferimenti

Galle, P. R., et al. EASL Clinical practice guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 69, 182-236 (2018).
Marquardt, J. U., Andersen, J. B., Thorgeirsson, S. S. Functional and genetic deconstruction of the cellular origin in liver cancer. Nature Reviews Cancer. 15, 653-667 (2015).
Balogh, J., et al. Hepatocellular Carcinoma: A review. Journal of Hepatocellular Carcinoma. 3, 41-53 (2016).
Perumpail, R. B., Womg, R. J., Ahmed, A., Harrison, S. A. Hepatocellular carcinoma in the setting of non-cirrhotic non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: US experience. Digestive Diseases and Science. 60, 3142-3148 (2016).
Baglieri, J., Brenner, D. A., Kisseleva, T. The role of fibrosis and liver associated fibroblasts in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20, 1723 (2019).
Arriazu, E., et al. Extracellular matrix and liver disease. Antioxidants & Redox Signaling. 21 (7), 1078-1097 (2014).
Malarkey, D. E., Johnson, K., Ryan, L., Boorman, G., Maronpot, R. R. New insight into functional aspects of liver morphology. Toxicologic Pathology. 33, 27-34 (2005).
Moreira, R. K. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Archive of Pathology and Lab Medicine. 131, 1728-1734 (2007).
Hernandez-Gea, V., Toffanin, S., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma. Gastroenteroloy. 144, 512-527 (2013).
Amicone, L., Marchetti, A. Microenvironment and tumor cells: two targets for new molecular therapies of hepatocellular carcinoma. Translational Gastroenterology and Hepatology. 3, 24 (2018).
Rawal, P., et al. Endothelial cell-derived TGF-B promotes epithelial-mesenchymal transition via CD133 in Hbx-Infected Hepatoma cells. Frontiers in Oncology. 9 (308), 1-9 (2019).
Yoo, J. E., et al. Progressive enrichment of stemness features and tumour stromal alterations in multistep hepatocarcinogenesis. PLoS One. 12 (3), 0170465 (2017).
Landry, B. D., et al. Tumor-stroma interactions differentially alter drug sensitivity based on the origin of stromal cells. Molecular Systems Biology. 14, 8332 (2018).
Le, B. D., et al. Three-dimensional hepatocellular carcinoma/fibroblast model on a nanofibrous membrane mimics tumor cell phenotypic changes and anticancer drug resistance. Nanomaterials. 8 (64), 1-11 (2018).
Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14, 6999-7010 (2017).
Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and animal models: Are 3D cultures the ideal tool to study cancer-microenvironment interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (181), 1-24 (2018).
Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20, 800-812 (2018).
Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2010).
Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: focus on tumor spheroid model. Pharmacology Therapy. 163, 94-108 (2016).
Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
Jung, H. R., et al. Cell spheroids with enhanced aggressiveness to mimic human liver cancer in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7, 10499 (2017).
Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. -. K., Ertl, P., Küpcü, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D hepg2 spheroid model. Scientific Reports. 9, 4863 (2019).
Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2 (2), 123-135 (2013).
Wrzesinski, K., et al. Human liver spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold of liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
Ma, X., et al. Rapid 3D bioprinting of decellularized extracellular matrix with regionally varied mechanical properties and biomimetic microarchitecture. Biomaterials. 185, 310-321 (2018).
Mueller, S., Sandrin, L. Liver stiffness: a novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
Wang, M. H., et al. In vivo quantification of liver stiffness in a rat model of hepatic fibrosis with acoustic radiation force. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (10), 1709-1721 (2009).
Georges, P. C., et al. Increased liver stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 293, 1147-1154 (2007).
Massironi, S., et al. et al. Liver stiffness and hepatocellular carcinoma: is it really useful. Journal of Hepatology. 58, 293 (2013).
Singh, S., et al. Liver stiffness is associated with risk of decompensation, liver cancer, and death in patients with chronic liver diseases: A systematic review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 11, 1573-1584 (2013).
Yang, T. S., Wang, C. H., Hsieh, R. K., Chen, J. S., Fung, M. C. Gemcitabine and doxorubicin for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma: a phase I-II trail. Annals of Oncology. 13, 1771-1778 (2002).
Le Grazie, M., Biagini, M. R., Tarocchi, M., Polvani, S., Galli, A. Chemotherapy for hepatocellular carcinoma: the present and the future. World Journal of Hepatology. 9 (21), 907-920 (2017).
Saneyasu, T., Akhtar, R., Sakai, T. Molecular cues guiding matrix stiffness in liver fibrosis. BioMed Research International. 2016, 1-11 (2016).
Zuliani-Alvarez, L., Midwood, K. S. Fibrinogen-related proteins in tissue repair: how a unique domain with common structure controls diverse aspects of wound healing. Advances in Wound Care. 4 (5), 273-285 (2015).
Smit, T., et al. Characterization of an alginated encapsulated LS180 spheroid model for anti-colorectal cancer compound screening. ACS Medicinal Chemistry Letters. 11 (5), 1014-1021 (2020).
Schrader, J., et al. Matrix stiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 53 (4), 1192-1205 (2011).
Lachowski, D., et al. Matrix stiffness modulates the activity of MMP-9 and TIMP-1 in hepatic stellate cells to perpetuate fibrosis. Scientific Reports. 9, 7299 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Calitz, C., Pavlović, N., Rosenquist, J., Zagami, C., Samanta, A., Heindryckx, F. A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties. J. Vis. Exp. (162), e61606, doi:10.3791/61606 (2020).