I detta metoddokument presenterar vi en screeningstrategi med hög genomströmning för att identifiera kemiska föreningar, såsom osmolyter, som har en betydande inverkan på bakteriell persistens.
Bakteriell persisters definieras som en liten subpopulation av fenotypiska varianter med förmågan att tolerera höga koncentrationer av antibiotika. De är ett viktigt hälsoproblem eftersom de har associerats med återkommande kroniska infektioner. Även om stokastisk och deterministisk dynamik av stress-relaterade mekanismer är kända för att spela en betydande roll i persistens, mekanismer som ligger till grund för fenotypiska övergången till/från persistens tillstånd är inte helt förstådda. Även om beständighetsfaktorer som utlöses av miljösignaler (t.ex. utarmning av kol-, kväve- och syrekällor) har studerats i stor utsträckning, har osmolytornas inverkan på persistens ännu inte fastställts. Med hjälp av mikroarrays (dvs. 96 brunnsplattor som innehåller olika kemikalier) har vi utformat ett tillvägagångssätt för att belysa effekterna av olika osmolyter på Escherichia coli persistens på ett högt genomströmningssätt. Detta tillvägagångssätt är omvälvande eftersom det lätt kan anpassas för andra screeningsystem, såsom läkemedelspaneler och gen knockout-bibliotek.
Bakteriekulturer innehåller en liten subpopulation av persisterceller som tillfälligt är toleranta mot ovanligt höga nivåer av antibiotika. Persisterceller är genetiskt identiska med deras antibiotikakänsliga släktingar, och deras överlevnad har tillskrivits övergående tillväxthämning1. Persister celler upptäcktes först av Gladys Hobby2 men termen användes först av Joseph Bigger när han identifierade dem i penicillin-behandlade Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminal studie publicerad av Balaban et al.4 upptäckte två persistertyper: typ I-varianter som främst bildas genom passage genom den stationära fasen och typ II-varianter som kontinuerligt genereras under den exponentiella tillväxten. Persisters detekteras av clonogenic överlevnadsanalyser, där odlingsprover tas med olika intervall under antibiotikabehandlingar, tvättas och pläteras på ett typiskt tillväxtmedium för att räkna de överlevande cellerna som kan kolonisera i avsaknad av antibiotika. Förekomsten av persisters i en cellkultur bedöms av en bifasiskdödskurva 4,5 där det första exponentiella förfallet indikerar döden av antibiotikakänsliga celler. Men mördartrenden minskar med tiden, vilket så småningom leder till en platåregion som representerar de överlevande persistercellerna.
Persister celler har associerats med olika sjukdomar såsom tuberkulos6,cystisk fibros7,candidiasis8 och urinvägsinfektioner9. Nästan alla mikroorganismer som testats hittills konstaterades generera persister fenotyper, inklusive högpatogen Mycobacterium tuberkulos6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 och Candida albicans8. Nyligen genomförda studier ger också bevis för ökningen av multiresistenta mutanter från persister subpopulationer11,12. Betydande insatser på detta område har visat att uthållighetsmekanismerna är mycket komplexa och olika. Både stokastiska och deterministiska faktorer i samband med SOS svar13,14,reaktiva syre arter (ROS)15,toxin/antitoxin (TA) system16,autofagi eller självsmälta17 och ppGpp-relaterade strängasvar 18 är kända för att underlätta persister bildas.
Trots betydande framsteg i förståelsen av den envishet fenotyp, effekterna av osmolyter på bakteriell persistens har inte förståtts fullt ut. Eftersom upprätthållandet av optimalt osmotiskt tryck är en nödvändighet för cellernas tillväxt, funktion och överlevnad, kan en djupgående studie av osmolyter leda till potentiella mål för anti-persister strategier. Även om mödosam screening med hög genomströmning är ett mycket effektivt tillvägagångssätt för att identifiera metaboliter och andra kemikalier som spelar en avgörande roll i den envisa fenotyp19,20. I detta arbete kommer vi att diskutera vår publicerade metod19, där vi har använt mikroarrays, dvs 96 brunnsplattor som innehåller olika osmolyter (t.ex. natriumklorid, urea, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumklorid), för att identifiera osmolyter som väsentligt påverkar E. coli persistens.
Den höga genomströmning persister analys beskrivs här utvecklades för att klargöra effekterna av olika kemikalier på E. coli persistens. Förutom kommersiella PM-plattor kan mikroarrayer konstrueras manuellt enligt beskrivningen i steg 4.2. Dessutom är protokollet som presenteras här flexibelt och kan användas för att screena andra mikroarrays, såsom läkemedelspaneler och cellbibliotek, som finns i 96 brunnsplåtformat. Försöksförhållandena inklusive tillväxtfasen, vaccinationshastigheten och me…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka medlemmarna i Orman Lab för deras värdefulla insatser under denna studie. Denna studie finansierades av NIH/ NIAID K22AI125468 karriärövergångsutmärkelse och ett university of Houston startup-bidrag.
14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |