I denne metode papir, præsenterer vi en høj-gennemløb screening strategi for at identificere kemiske forbindelser, såsom osmolytter, der har en betydelig indvirkning på bakteriel persistens.
Bakterie persisters er defineret som en lille delpopulation af fænotypiske varianter med evnen til at tolerere høje koncentrationer af antibiotika. De er et vigtigt sundhedsproblem, da de har været forbundet med tilbagevendende kroniske infektioner. Selv om man ved, at stokastiske og deterministiske dynamikker i stressrelaterede mekanismer spiller en væsentlig rolle i persistensen, forstås de mekanismer, der ligger til grund for det fænotypiske skift til/fra persistenstilstanden, ikke fuldstændigt. Mens vedvarende faktorer udløst af miljøsignaler (f.eks. udtømning af kulstof-, nitrogen- og iltkilder) er blevet grundigt undersøgt, er osmolytternes indvirkning på persistens endnu ikke fastlagt. Ved hjælp af mikroarrays (dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige kemikalier), har vi designet en tilgang til at belyse virkningerne af forskellige osmolytter på Escherichia coli persistens på en høj gennemløbsmåde. Denne tilgang er transformativ, da den let kan tilpasses til andre screening arrays, såsom lægemiddelpaneler og gen knockout biblioteker.
Bakteriekulturer indeholder en lille delpopulation af persister celler, der er midlertidigt tolerante over for usædvanligt høje niveauer af antibiotika. Persister celler er genetisk identiske med deres antibiotika-følsomme kins, og deres overlevelse er blevet tilskrevet forbigående vækst hæmning1. Persister celler blev først opdaget af Gladys Hobby2, men udtrykket blev først brugt af Joseph Bigger, da han identificerede dem i penicillin-behandlede Staphylococcus pyogenes kulturer3. En skelsættende undersøgelse offentliggjort af Balaban et al.4 opdagede to vedholdende typer: type I-varianter, der primært dannes ved passage gennem den stationære fase, og type II-varianter, der kontinuerligt genereres under eksponentiel vækst. Persisters opdages ved clonogenic overlevelsesanalyser, hvor kulturprøver tages med forskellige intervaller under antibiotikabehandlinger, vaskes og belægges på et typisk vækstmedium for at tælle de overlevende celler, der kan kolonisere i mangel af antibiotika. Eksistensen af persisters i en cellekultur vurderes af en bifasisk kill curve4,5 hvor det oprindelige eksponentielle henfald indikerer antibiotikafølsomme cellers død. Men drabstendensen falder over tid, hvilket i sidste ende fører til et plateauområde, der repræsenterer de overlevende vedholdende celler.
Persisterceller har været forbundet med forskellige sygdomme som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinvejsinfektioner9. Næsten alle mikroorganismer, der hidtil er blevet testet, viste sig at generere persister fænotyper, herunder højpatogen Mycobacterium tuberkulose6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nylige undersøgelser viser også , at der er fremgangen af multiresistente mutanter fra vedvarende delpopulationer11,12. En betydelig indsats på dette område har vist, at vedholdenhedsmekanismerne er meget komplekse og forskelligartede; både stokastiske og deterministiske faktorer i forbindelse med SOS-respons13,14, reaktive iltarter (ROS)15, toksin-/antitoksinsystemer (TA)16, autofagi eller selvfordøjelse17 og ppGpp-relateret stringentrespons 18 er kendt for at lette persisterdannelsen.
På trods af betydelige fremskridt med at forstå persistens fænotypen er virkningerne af osmolytter på bakteriel persistens ikke blevet fuldt forstået. Da opretholdelsen af optimalt osmotisk tryk er en nødvendighed for cellernes vækst, funktion og overlevelse, kan en dybdegående undersøgelse af osmolytter føre til potentielle mål for anti-persister strategier. Selv om besværlige, høj-gennemstrømning screening er en meget effektiv tilgang til at identificere metabolitter og andre kemikalier, der spiller en afgørende rolle i vedholdenhed fænotype19,20. I dette arbejde vil vi diskutere vores offentliggjorte metode19, hvor vi har brugt mikroarrays, dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige osmolytter (f.eks. natriumchlorid, urinstof, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumchlorid), for at identificere osmolytter, der har væsentlig indflydelse på E. coli persistens.
Den høje gennemstrømning persister assay beskrevet her blev udviklet for at belyse virkningerne af forskellige kemikalier på E. coli persistens. Ud over kommercielle PM-plader kan mikroarrays konstrueres manuelt som beskrevet i trin 4.2. Desuden er den protokol, der præsenteres her, fleksibel og kan bruges til at screene andre mikroarrays, såsom lægemiddelpaneler og cellebiblioteker, der er i 96 brøndpladeformater. De eksperimentelle forhold, herunder vækstfasen, vaccinationshastigheden og mediet, kan ju…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af Orman Lab for deres værdifulde input i løbet af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH / NIAID K22AI125468 karriere overgang tildeling og en University of Houston start tilskud.
14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |