单细胞级别研究形状依赖性转录组学的方法

所有涉及动物的程序都符合瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所动物伦理委员会的规定。 1. 微型芯片布局 使用定制设计的芯片（材料表）（图1A）：19.5毫米×19.5毫米盖玻片，带活性微表，用硅酸盐玻璃的光刻打印。注：这些微模式被细胞恐惧症区域包围。因此，种子细胞只能附着并生长在这些微模式之一上，并捕获该微模式的AR。芯片分为三个区域，每个区域由具有特定AR的微模式组成。芯片布局如图 1B所示。已定义的 AR 的几何体见表 1。图1B中下部图像显示了纤维素微模式不同形状的 放大荧光图像。 2. 涂层微层芯片 通过将 80 μg 的纤维素添加到 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS-/-） 中，为每个芯片准备 2x 涂层蛋白溶液。 将芯片转移到 35 毫米格雷纳培养皿中，并立即添加 2 mL 的 PBS-/-。然后加入2mL的2x涂层蛋白溶液。 在室温下孵育芯片2小时。 使用 PBS-/-连续稀释步骤清洗涂层溶液。芯片表面应始终为湿。然后，用2 mL的电镀介质代替PBS，在37°C下孵育，直到播种细胞。 3. 隔离 VM 通过补充DMEM：M199（4：1）与10%的马血清，4%胎儿牛血清，2%HEPES（1 M）和1%青霉素/链霉素（10，000 U/mL）准备电镀介质22。 从2天大的新生儿心脏的左心室解剖组织，并转移到含有PBS的10厘米培养皿中。将组织切成大约1毫米3 块。 将收获的组织转移到转子盖管中，在组织分离的盖子中装有转子（材料表）。让组织安定下来，然后小心地取出上清液。 将酶混合物1和2的混合物2.5 mL加入C管中，并紧闭盖子。 将转子盖管插入分离器的套筒上，配备加热器（图 2A 和 B） （材料表）。运行孵化程序37C_mr_NHDK_1（图2C），持续约一小时。 当孵育程序运行时，在PBS中准备含有2 mM EDTA和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PEB缓冲液，pH 7.2，并保持在4°C。 孵化程序终止后，分离转子盖管（图2D），并添加7.5 mL预热电镀介质。 重新悬浮样品，并使用 70 μm 滤株过滤细胞悬浮液。 用另外 3 mL 的电镀介质清洗过滤器。 以 600 x g 离 心电池悬架 5 分钟。完全吸上一道。 将细胞颗粒重新在60μL的冷PEB缓冲液中。 加入20μL的新生儿心肌细胞分离鸡尾酒（材料表），含有微米大小的珠子，针对非CMs。 加入20μL的抗红血球珠（材料表）。 在4°C下混合悬浮液并孵育15分钟。 添加 400 μL 的 PEB 缓冲液。 将电池悬浮液应用到LD柱（材料表）上，该柱已垂直插入磁铁支架，用PEB缓冲液洗涤良好。 收集未标记的细胞，用 0.5 mL 的 PEB 缓冲液清洗柱。 加入8 mL的电镀介质，将细胞悬浮液转移到75厘米2 无涂层培养瓶中，并在37°C孵育1.5小时。剩余的非CM将开始粘附于未涂覆的细胞培养，细胞悬浮液将由CM群体丰富。 4. 模式化 VM 注：我们将单个 CMs 与 1：1、7：1 或 11：1 的 ARs 进行比较。这是通过将孤立的新生儿CMs播种到一个特别设计的芯片上，该芯片填充了纤维素涂层的微模式，定义的 AR为1：1、7：1或11：1。微表层被纤维素涂层，周围是细胞恐惧症表面。因此，CMs 将仅通过生长在纤维素基材上来附加、传播和捕获微模式的已定义 AR。根据以下步骤对隔离的 VM 进行阵列。 将细胞悬浮液转移到15 mL管中，通过添加适当的电镀介质，计算细胞并稀释至每mL100，000个细胞的浓度。 将 2 mL 的电池悬浮液添加到芯片上，芯片已浸入 2 mL 的 2 mL 热电镀介质中，位于 35 mm Greiner Petri 盘中。 在37°C下用5%CO2孵育该盘， 使CM附着在纤维素涂层微模式上，并允许每个CM获得其基板微模式的AR。 18 小时后，检查芯片。如果大多数细胞已连接，则分离并清除附着在图案细胞上的碎屑和死细胞。为此，请移除电镀介质，轻轻添加 PBS-/- 滴，从芯片中心开始，然后向两侧移动。重复2次。 通过补充DMEM：M199（4：1）与4%马血清、4%胎儿牛血清、2%HEPES（1 M）和1%青霉素/链霉素（10，000 U/mL）一起吸气PBS。 5. 挑选粘附的 VM 注：经过72小时的培养期后，使用半自动细胞拾取器（材料表）从其纤维素微模式中选取图案单一CM（图3）。单元拾取器使用软件23来控制电动阶段（图3A）。70 μm玻璃微胶囊（图3B）用于挑选和注射有图案的新生儿大鼠CMs。细胞拾取器通过产生真空和通过施加压力对粘附细胞进行排序。使用注射器泵拉注射器（图3C）应用注射器1号中的真空。静液压基于重力，通过将注射器 2 号放在显微镜台上 87 厘米的距离来感应。注射器 1 和 2 分别通过 PTFE 管连接到嵌入控制单元中的阀门 1 和 2（图 3D）。PTFE 管完全充满无 RNase 水。然后将采摘的单细胞注入聚合酶链反应（PCR）管，其中含有3.55μL的解解缓冲液。 经过72小时的培养后，取出旧介质，用温暖的DPBS-/-轻轻冲洗芯片表面。 保持盘子平整，用1000μL移液器从盘子的一侧轻轻吸气旧介质。确保芯片一直保持湿润。 添加 2 mL 的 DPBS-/- 轻轻和滴式分离连接到图案细胞的大多数死细胞，从芯片的中心开始，然后移动到其两侧。 吸气大部分的DPBS去掉尽可能多的分离的浮动细胞，从芯片的中心开始，然后移动到两侧。 再次重复步骤 5.1.2 和 5.1.3。 使用倾斜钳抓住芯片的边缘，并立即将其转移到一个新的无菌35毫米Greiner Petri盘，以减少浮动细胞的数量，而采摘。 立即添加 1.5 mL 的 DPBS-/- 使芯片不会干涸。 添加 1.5 μL 的”活力染料循环绿色”，以可视化活细胞的核。 使用钳子尖端将芯片放在格雷纳培养皿的中心。 在芯片上放一个腔室 （ 材料表 ） .腔室将芯片固定到盘子的底部，而不会阻止对细胞模式的访问。 将Greiner Petri 盘安装到细胞拾取器阶段的菜架上，然后插入磁盖。 校准自动喷射。 找到刻在”实时视图”窗口中图像中间的图像中间的电动舞台上的十字线。 聚焦十字线，并在 扫描和分拣窗口中 选择 自动喷射按钮的校准 。 将 DPBS-/- 更换为 1.5 mL 的 DPBS/trypsin-/- （1：1）， 而菜台在舞台上， 以松开细胞从纤维素， 以便一个流体真空可用于采摘细胞. 使用扫描和排序 窗口中的 扫描选项卡 扫描整个 芯片。在视野中找到芯片的左上角，然后单击左 上角行中的”获取 当前显微镜位置”。 然后，将电动舞台移动到芯片的右下角。聚焦显微镜，然后单击 右下角行的 “获取当前显微镜位置”。 单击” 设置最锐利的 平面”按钮，在弹出的窗口上 单击”转到右上角”。聚焦显微镜并单击 “转到左下角并 设置焦点”。完成后，单击” 完成 “按钮并开始扫描。 当扫描终止时，转到”分析 ” 选项卡并选择通过研究标准的单个单元格。 确保玻璃微胶囊位于显微镜的实时视图中间。 使用软件的泵 窗口控制 注射器泵。从直径为 27 mm 的 50 mL 1 号注射器中提取 4 mL，从而产生真空。 在” 排序” 选项卡中 设置阀门的喷射参数。计算出，如果阀 2 打开 120 毫秒，则交付拾取单单元的喷射量为 1 μl，则阀 1 打开 20 毫秒，在时间间隔 200 毫秒后为毫秒。由于管子的弹性，打开阀门1停止注入流量。 设置阀门的拾取参数。计算出，如果阀 1 打开 20 毫秒，然后阀 2 打开 10 毫秒，在时间间隔 10 毫秒后，可以拾取大多数图案单元。这是因为他们的纤维素结合被使用三辛治疗后松动。 单击” 计算路径” 按钮。该软件计算从细胞到细胞的最快路径，以在整个芯片中拾取和注入选定的细胞。 将显微镜聚焦在芯片表面的图案细胞上。 使用操纵手柄，小心地向下移动微胶囊，这样无需接触电池即可获得微胶囊尖端最清晰的图像。 单击微 移 管偏移 部分中的”设置” 按钮。将弹出一个新窗口，显示微缩线横截面。单击毛细管的确切中心。然后，软件将在 x、y 和 z 坐标中记录毛细管的尖端偏移。 使用”开始排序 “按钮启动 排序。