Quantifizierung von Spontan-Ca^2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Alle Verfahren zur Verwendung von tierischen Gegenständen wurden vom Institutional Animal Care and Useth Committee der Texas A&M University genehmigt (25. Nov 2019; AUP-Nr. 2019-0346). HINWEIS: Die Herstellung von Zellkulturlösungen sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank mit sterilem Verfahren erfolgen und mit 0,2 m gefiltert werden, um eine Kontamination zu verhindern. 1. Vorbereitung von Lösungen und Kulturmedium Bereiten Sie die Lamininbeschichtungslösung vor, indem Sie 20 l 1 mg/ml Lamininvorrat in 2 ml steril destilliertesH2O verdünnen. Am Tag der Zerlegung vorbereiten. Bereiten Sie 10% Pferde (Pferd) Serum (ES) Stop-Lösung vor, indem Sie 5 ml ES zu 45 ml 1x Hank es Balanced Salt Solution (HBSS) hinzufügen. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem oder Spritzenfilterspitze. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 4% Rinderserumalbumin (BSA) Stofflösung vor, indem Man 2 g BSA-Pulver zu 1x phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) hinzufügt und ein Endvolumen von 45 ml erreicht. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem oder Spritzenfilterspitze. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie Papain-Stammlösung durch Verdünnen von Papain auf 3 mg/ml in 1x HBSS vor. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem oder Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern. Bereiten Sie die Desoxyribonuklease (DNase) Lösung vor, indem Sie 20 mg DNase-Pulver zu sterilemH2O hinzufügen und ein Endvolumen von 20 ml erreichen. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem oder Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern. Bereiten Sie Ascorbinsäure-Stammlösung vor, indem Sie 352 mg Ascorbinsäure zu steril destilliertemH2O hinzufügen und ein Endvolumen von 20 ml erreichen. Im 37 °C-Bad erhitzen, um sich bei Bedarf aufzulösen. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem oder Spritzenfilterspitze. Bei -20 °C lagern. Bereiten Sie Cell Culture Medium vor, indem Sie folgendes zu 50 ml neurobasalem Medium hinzufügen: 500 l Glutamax (100x), 500 l Pferdeserum, 1 ml B-27, 100 l Ascorbinsäure, 500 l Penicillin-Streptomycin, 50 l Kanamycin und 50 l Apicillin. Sterilfilter mit einem 0,2-mm-Filtersystem. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie 0,01% Triton X-100 Solution vor, indem Sie 1 ml Triton X-100 in 9 ml 1x PBS hinzufügen, um eine 10%-Lösung zu schaffen. Da Triton X-100 zähflüssig ist, Pipette langsam, damit Spitze vollständig füllen. Im 37 °C-Bad erhitzen, um sich bei Bedarf aufzulösen. Bei 4 °C lagern. Um 10% Triton X-100 Aktie auf 0,01% zu verdünnen, führen Sie 3 serielle 1:10 Verdünnungen durch. 1 ml 10% Lager in 9 ml 1x PBS verdünnen, um 1% Lösung zu machen. 1 ml 1% Lösung in 9 ml 1x PBS verdünnen, um eine 0,1%-Lösung zu machen. Verdünnen Sie 1 ml 0,1% Lösung in 9 ml 1x PBS, um eine 0,01% Lösung zu machen. Bereiten Sie 10% und 1% normale Ziegenserum (NGS) Lösung vor, indem 1 ml NGS zu 9 ml 1x PBS für eine 10% Lösung hinzugefügt wird. Fügen Sie 100 l NGS zu 9,9 ml 1x PBS hinzu, um eine 1%-Lösung zu schaffen. Bereiten Sie Glutamat-Lagerlösung (100 mM) durch Zugabe von 735 mg L(+)-Glutaminsäure zu steril destillierth2 Ound bringen Sie ein Endvolumen von 50 ml. Die Löslichkeit bei dieser Konzentration wird ein Thema sein. Die Zugabe kleiner Volumina (100 l) von 1 M Salzsäure reicht aus, um die Löslichkeit zu erhöhen. Bereiten Sie die NBQX-Lagerlösung (10 mM) vor, indem Sie 50 mg NBQX zu steril destilliertemH2O hinzufügen und ein Endvolumen von 13 ml erreichen. 2. Zubereitung von Kulturgerichten und Coverlips (am Tag vor der Zerlegung) HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass die Kombination von drei Beschichtungsmitteln, Poly-L-Lysin, Poly-L-Ornithin und Laminin, eine ideale Zellhaftung und -lebensfähigkeit ermöglicht. 10 35 mm Petrischalen in einen biologischen Sicherheitsschrank geben. Legen Sie zwei kreisförmige 12 mm Abdeckungen in jede Schale und füllen Sie mit 70% EtOH für 10 min. Verwenden Sie eine Vakuumleitung, um den verbleibenden EtOH von jeder Schale zu aspirieren, so dass der EtOH vollständig verdampfen kann. Pipetten mit einer Lösung von 0,1 % Poly-L-Lysin auf jedem Deckelschlupf, um sicherzustellen, dass der gesamte Deckslip durch die Poly-L-Lysin-Lösung abgedeckt wird. Die Teller mit Deckeln bedecken und 1 H in einen 37 °C-Inkubator geben. Restliche Poly-L-Lysin-Lösung aus jedem Deckschein aspirieren und mit sterilemH2O abspülen. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 – 2.3 mit 0,1% Poly-L-Ornithin-Lösung. Wiederholen Sie erneut die Schritte 2.2 – 2.3 mit 0,01% Lamininlösung. In einen 37 °C/5%CO2-Inkubator geben, bis er am nächsten Tag zur Zellbeschichtung bereit ist. 3. Maus embryonale Sezierungen HINWEIS: Wir verwenden zwischen 4 bis 6 getächte teerierte Mäuse pro Kultur. Während ein Großteil des Sezierprozesses außerhalb eines biologischen Sicherheitsschranks stattfindet, ist es immer noch wichtig, ein steriles Verfahren aufrechtzuerhalten. Der reichliche Einsatz von 70% EtOH auf Oberflächen in der Nähe des Seziermikroskops und auf chirurgischen Werkzeugen ist ideal. Eine Maske kann auch während der Zerlegung getragen werden, um eine Kontamination weiter zu verhindern. Zusätzlich verwenden wir 4 separate Antibiotika im Kulturmedium, so dass eine Kontamination unwahrscheinlich ist. Wenn jedoch der Einsatz von Antibiotika problematisch ist, könnte diese Seziereinrichtung in eine sterile Haube verschoben werden. Um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten, sollten alle Sezierlösungen bei 4 °C vorgekühlt und die Sezierungen so schnell wie möglich abgeschlossen werden. Wir führen die Sezierungen nicht auf Eis durch. Die Methode zur Zerlegung von embryonalen Mittelhirnneuronen der Maus ist identisch mit den zuvor beschriebenen Methoden9,10. Bereiten Sie einen Raum auf einer Bank in der Nähe eines Seziermikroskops mit einem saugfähigen Pad vor und sprühen Sie großzügig mit 70% EtOH. Sprühen Sie zwei 100 x 15 mm Glas Petrischalen und eine 50 x 10 mm Glas Petrischale mit 70% EtOH und lassen Sie EtOH verdampfen. Nach dem Verdampfen 50 ml sterile 1x HBSS in jede 100 x 15 mm Petrischale geben. Untertauchen Sie chirurgische Schere, Zange und Mikrotom Klinge in 70% EtOH für 10 min Minimum zu sterilisieren. Legen Sie die Instrumente auf das saugfähige Pad zum Trocknen. Mit CO2 gefolgt von Zervixdislokation, euthanisieren 2-3 Monate alte zeitgezeitente Schwangerschaft Mäuse am embryonalen Tag 14. Sprühen Sie den Bauch der eingeschläferten Mäuse mit 70% EtOH. Mit Zangen greifen Sie den Unterbauch und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer chirurgischen Schere. Beginnen Sie zu schneiden in der Nähe, wo die Zange halten den Bauch, seitliche Schnitte auf jeder Seite, bis die Bauchwand zurückgeklappt werden kann und die Gebärmutter deutlich sichtbar ist. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere beide Enden des Gebärmutterhorns. Dann entfernen Sie die Gebärmutter und legen Sie in Petrischale mit 1x HBSS. Mit geraden Spitzenzangen entfernen Sie embryonen vorsichtig aus der Gebärmutter. Lassen Sie Embryonen während dieses Gesamtensprozesses in HBSS. Mit der Zange oder einer Mikrotomklinge, enthaupten Sie Embryonen schnell, indem Sie in der Nähe des Halses schneiden. So gleichnglich wie möglich. Unter einem Sezieren mikroskop, bewegen Sie einen Embryokopf auf eine trockene 50 mm Petrischale und legen Sie sie auf die ventrale Seite. Stabilisieren Sie den Kopf mit Zangen, indem Sie die Augen/Schnout platzieren und durchdringen. Zangen sollten bei 45° nach unten gewinkelt werden, um ein Eindringen in das Mesencephalon zu vermeiden. Mit den Zangen in der anderen Hand, vorsichtig entfernen Sie die transluzente Schicht von Haut und Schädel kurz vor dem prominenten Grat des Mesencephalons. Beginnen Sie in der Nähe der Mittellinie und entfernen Sie Haut und Schädel kauarisch, bis das Mesencephalon vollständig ausgesetzt ist. Halten Sie die Zange senkrecht zum exponierten Mesencephalon mit einer Spitze zwischen Kortex und Mesencephalon und die andere in der Nähe des Kleinhirns. Drücken Sie nach unten und kneifen Sie die Zange zusammen, um das gesamte Mittelhirn zu entfernen. Das Mittelhirnsegment sollte etwa 0,5 mm dick sein. Legen Sie das Midbrain-Segment in die zweite Petrischale gefüllt mit frischen 1x HBSS. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Embryo. Positionieren Sie das Hirnsegment mit dem Seziermikroskop nach oben. Wenn die Meningen noch befestigt sind, entfernen Sie es vorsichtig, indem Sie mit der Zange greifen und sich vom Gehirnsegment erheben. Das Gehirnsegment sollte 4 sichtbare Quadranten haben. Platzieren Sie das Segment so, dass die beiden kleineren Quadranten den beiden größeren Quadranten überlegen sind. Es gibt einen markanten Grat, der die oberen zwei (kleinen) Quadranten von den unteren zwei (großen) Quadranten trennt. Mit den Zangen kneifen und trennen Sie die überlegenen Quadranten von den unteren Quadranten, und entsorgen Sie dann die überlegenen Quadranten. Die verbleibenden unteren Quadranten haben überschüssiges Gewebe seitlich auf der rückenseitigen Seite, dieses Gewebe wird weniger undurchsichtig aussehen als das verbleibende ventrale Gewebe. Entfernen Sie das weniger dichte Rückengewebe und entsorgen Sie es. Das verbleibende Segment sollte sowohl die Substantia nigra pars compacta (SNc) als auch den ventralen Tegmentalbereich (VTA) enthalten. Mit den Zangen schneiden Sie das verbleibende ventrale Gewebesegment in 4 kleinere Stücke und übertragen sie mit einer 1ml breiten Bohrungspipette in einem 15 ml konischen Rohr mit 1x HBSS. Halten Sie die konische Röhre mit Hirnsegmenten während des gesamten Verfahrens auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Gehirnsegmente. 4. Dissoziation von Zellen Enzymatische Verdauung von Zellen Saugen Sie die HBSS vorsichtig aus dem 15 ml konischen Rohr, das Mittelhirnsegmente enthält, sodass die Segmente an der Unterseite des Rohres bleiben. Die Papainlösung mit einer Papainlösung in die Tube geben und 7 min in einen 37 °C-Inkubator geben. Setzen Sie die Zellen durch Streichen des Rohres aus und ersetzen Sie den 37 °C-Inkubator für weitere 7 min. Mit einer breitbohrung1 ml Pipettespitze entfernen Sie nur die Mittelhirnsegmente in ein 1 ml Aliquot von DNase. Lassen Sie die Segmente den Boden des Aliquot s oder etwa 1 min der Exposition erreichen. Mit einer breitbohrung1 ml Pipettespitze entfernen Sie nur die Mittelhirnsegmente in ein 15 ml konisches Rohr mit 2 ml Stop-Lösung. Lassen Sie Segmente an der Unterseite des Rohres absetzen und wiederholen Sie die Spülung in einem zusätzlichen konischen Rohr, das mit Stop-Lösung gefüllt ist. Mechanische Triturierung der Zellsuspension In der zweiten Stop-Lösung Spülrohr, mit einer Breitbohrung 1 ml Pipettenspitze, Pipette die Zellen nach oben und unten 10 Mal, bis es keine großen Gewebesegmente sichtbar sind. Es ist wichtig, eine Übertrituration bei minimaler Zelllyse zu vermeiden. Langsam Pipette 300 l von 4% BSA-Lösung an der Unterseite des 15 ml konischen Rohres mit Hirnsegmenten. Entfernen Sie vorsichtig die Pipettenspitze, um eine Suspensionsschicht zu halten. Zentrifuge bei 0,4 x g für 3 min. Dann saugen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Zellen in 400 l Zellkulturmedium. 5. Plattieren der Zellen HINWEIS: Erfahrungsgemäß werden etwa 100.000 lebensfähige Zellen pro Embryo gesammelt. 2-3 Monate alt gezeite schwangere Mäuse haben in der Regel Wurfgrößen von 8-10 Embryonen; Daher beträgt eine grobe Schätzung für die Gesamtausbeute der Zellen pro getimten schwangeren Maus etwa 1 Million Zellen. Mit Hilfe eines Hämozytometers präformieren Sie eine Zellzahl und verdünnen Sie dann die Suspension mit dem Zellkulturmedium auf 2.000 Zellen/L. Trituieren Sie kurz zu mischen. Entfernen Sie Dielips mit Lamininlösung aus Schritt 2 aus dem Inkubator und saugen Sie die verbleibende Lamininlösung mit einem Vakuum aus den beschichteten Abdeckungen ab. Platte schnell, um zu vermeiden, dass die Abdeckungen vollständig trocknen. Pipette 100 l (2,0 x 105 Zellen/Coverslip) auf jeden Deckelschlupf und Petrischalen für 1 h in einen 37 °C-Inkubator geben. 3 ml Zellkulturmedium vorsichtig zu jedem Gericht hinzufügen und wieder in den 37 °C-Inkubator geben. Preform halb mittel ändert sich 2 mal pro Woche für 2 Wochen. 6. Infektion der Zellkultur bei 14 DIV mit Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren Für jede Schale 1 ml Serumfreies DMEM-Medium mit 1 l hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 Titer) vorbereiten Das Zellkulturmedium aus jedem Gericht ansaugen und durch 1 ml Serumfreies DMEM ersetzen, das hSyn-GCaMP6f enthält. Das Geschirr 1 H zurück in den 37 °C-Inkubator geben. Aspirieren Sie das serumfreie Medium, das AAVs enthält, und ersetzen Sie es durch 3 ml Zellkulturmedium. Legen Sie Gerichte wieder in den 37 °C-Inkubator. Wir haben festgestellt, dass 5-7 Tage AAV-Infektion ermöglicht ideale Niveaus der GCaMP-Expression. Weiterhin zu ändern Medium alle 2-3 Tage während dieser Periode der Virusinfektion. 7. Live konfokale Ca2+ Bildgebung zwischen 19-21 DIV HINWEIS: Wie in Schritt 6.3 erwähnt, kann die Bildgebung zwischen 5-7 Tagen nach einer Virusinfektion erfolgen. Dies ist das ideale Fenster, um eine sichtbare Expression des Fluorophors auf Ebenen zu erreichen, die die Detektion spontaner Ca2+-Aktivität ermöglichen. Vorbereitung von Aufzeichnungspuffern Um 1 L HEPES-Aufnahmepuffer zu erstellen, Hinzufügen: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-Glucose, 2,381 g HEPES, 2 ml 1 M CaCl2 Stofflösung und 500 l von 1 M MgCl2 Stammlösung auf 800 ml steril destillierte H2O. Bring den pH auf 7,4 mit NaOH. Bringen Sie auf ein endgültiges Volumen von 1 L. Um 200 ml 20 M Glutamat-Aufzeichnungspuffer zu bilden, verdünnen Sie die oben beschriebene Lösung von 40 l von 100 ml Glutamat in 200 ml HEPES-Aufzeichnungspuffer. Um 200 ml von 10 M NBQX Aufnahmepuffer zu machen, verdünnen Sie 200 l von 10 mM NBQX-Lagerlösung in 200 ml HEPES-Aufzeichnungspuffer. Konfokale Bildgebung Füllen Sie eine sterile 35 mm Petrischale mit 3 ml Aufnahmepuffer. Entfernen Sie eine 35 mm Petrischale mit infizierten Kulturen aus dem 37 °C Inkubator. Mit feinen Spitzenzangen, nehmen Sie vorsichtig die Kante eines Coverslip und übertragen Sie es schnell in die Petrischale mit Aufnahmepuffer gefüllt. Den restlichen Deckelin in Medium wieder in den 37 °C-Inkubator legen. Transportieren Sie die Schale mit Aufnahmepuffer zum konfokalen Mikroskop. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, während es initialisiert wird. Starten Sie die peristaltische Pumpe und legen Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer. Kalibrieren Sie die Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/min. Den infizierten Deckel aus der 35 mm Petrischale in das Aufnahmebad geben. Mit dem 10x Wasser-Immersionsobjektiv und BF-Licht, finden Sie die Ebene des Fokus und suchen Sie nach einer Region mit einer hohen Dichte von Neuronenzellkörpern. Wechseln Sie zum 40-fachen Wassertauchobjektiv und fokussieren Sie die Probe mit BF-Licht neu. Wählen Sie im Fenster “Farbstoffe liste” in FluoView AlexaFluor 488 aus und wenden Sie es an. AAV-Ausdruck kann variabel sein; um eine Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu verhindern, beginnen Sie daher mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Stellen Sie für den AlexaFluor 488-Kanal die Hochspannung (HV) auf 500, die Verstärkung auf 1x und den Offset auf 0 ein. Für die 488 Laserlinie stellen Sie die Leistung auf 5%. Um das in der Z-Ebene abgebildete effektive Volumen zu erhöhen, erhöhen Sie die Lochgröße auf 300 m. Verwenden Sie die Scanoption “Fokus x2”, um Emissionssignale optimal an die Subsättigung anzupassen. Von hier aus können die Einstellungen so lange angepasst werden, bis die ideale Sichtbarkeit jedes Kanals erreicht ist.HINWEIS: Um die gesamte Reichweite der Ca2+-Flussmittel mit GCaMP genau zu erfassen, passen Sie die grundlegenden HV- und Laserleistungseinstellungen an, um eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen, ohne den Detektor zu übersät. Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie die Bühne, um einen Bereich mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Veränderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz anzeigen, und fokussieren Sie sich zur Bildgebung auf die gewünschte Ebene. Verwenden Sie das Werkzeug “Clip rect”, um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Frameintervall von knapp 1 Sekunde erreichen kann. Dies ist erforderlich, um das Bildgebungsintervall auf 1 Frame pro Sekunde festzulegen. Legen Sie das Fenster “Intervall” auf einen Wert von 1,0 und das Fenster “Num” auf 600 fest.HINWEIS: Um verschiedene Aufnahmepuffer zum gewünschten Zeitpunkt (300 s) zu liefern, ist es wichtig, die Latenz der Pumpe zu kalibrieren, um die neue Lösung in das Bad zu liefern. Dies hängt von der Durchfusionsrate der Lösung (2 ml/min) und der Länge der Leitung ab, die zum Pumpen der Lösung verwendet wird. Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option “Zeit” und verwenden Sie dann die Scanoption “XYt”, um mit der Bildgebung zu beginnen. Beobachten Sie die Bildfortschrittsleiste und verschieben Sie die Leitung vom HEPES-Aufnahmepuffer in den 20-M-Glutamat-Aufzeichnungspuffer zum geeigneten Zeitpunkt (z. B. wenn die Latenz der Pumpe kalibriert ist, um eine Lösung bei 60 s zu liefern, bewegen Sie die Leitung mit 240 Frames in den Glutamatpuffer, um Glutamat bei 300 s zu liefern). Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche Series Done aus, und speichern Sie den fertigen T-Series-Film. Setzen Sie die Durchlässigkeit von 20 M Glutamat für weitere 5 min fort, so dass die kultivierten Neuronen insgesamt 10 min Glutamat ausgesetzt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden abzusichernden Schutzzettel. Nach der zusätzlichen Exposition von 5 min bei 20 M Glutamat entfernen Sie den Deckelausrutsche aus dem Bad und legen Sie ihn bis zum Tag der Bildgebung wieder in die 35mm Petrischale mit Aufnahmepuffer. Wenn Sie fertig sind, fahren Sie mit Schritt 8 fort. Ca2+ Spurenanalyse Führen Sie die Bildanalyse in ImageJ durch. Installieren Sie das BIO-FORMATS-Plugin für ImageJ, das erlaubt. OIB-Bilddateien zu öffnen. Klicken Sie in der ImageJ-Symbolleiste auf Analysieren | Legen Sie Messungenfest, und wählen Sie das Feld für den mittleren Grauwert (MGV) aus. Öffnen Sie in ImageJ einen T-Series-Film als Hyperstack. Ziehen Sie den Schieberegler für den Film und identifizieren Sie den Rahmen mit maximaler Glutamat-Antwort, um alle Neuronen zu visualisieren, die auf Glutamat reagieren. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um alle sichtbaren Neuronenzellkörper zu verfolgen und der Liste “ROI-Manager” ihre ROIs hinzuzufügen. Wenn die Ablaufverfolgung und das Hinzufügen von ROIs abgeschlossen ist, wählen Sie alle ROIs im FENSTER ROI Manager aus, und verwenden Sie die Auswahl mit mehreren Kennzahlen in der Liste der Optionen. Kopieren sie diese Daten, und fügen Sie sie in eine Kalkulationstabelle ein. Schließen Sie diesen Vorgang für alle zu analysierenden Filme ab. Konvertieren Sie für jeden ROI die rohen MGV-Daten aus jedem Frame in die Werte f/F0 mit der Gleichung: F/F0 = [F(t) – F0] / F0. Wobei F(t) = MGV eines bestimmten Rahmens und F0 = durchschnittlicher Basis-MGV von 10 Frames, bei denen keine Ca2+-Flussmittel vorhanden sind. Mit einer statistischen Software wie OriginPro 2020 können konvertierte F/F0-Spuren in Liniendiagramme umgewandelt werden. Die Funktion “Peak Analyzer” kann verwendet werden (oder eine ähnliche Funktion, wenn eine andere Software verwendet wird), um die maximale Amplitude der Glutamatreaktion, Latenz auf Glutamat und Fläche unter der Kurve zu messen. 8. Immunostainierung von Kulturen HINWEIS: Nach Fixierung mit Formalin können Coverlips in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden, bis sie zur Immunfärbung bereit sind. Primäre und sekundäre Antikörperinkubation erfolgte auf serielle Weise, als solche Inkubation mit Anti-Caspase-3 Primärantikörper und seinem komplementären sekundären Antikörper vor der Inkubation mit dem Anti-TH-Primärantikörper und seinem komplementären sekundären Antikörper. Unmittelbar nach Glutamat-Exposition den Deckelrutsch wieder in seine 35 mm Petrischale legen, den Aufnahmepuffer ansaugen und 3 ml 10% Formalin hinzufügen. Lassen Sie für 40 min bei Raumtemperatur (RT) sitzen. Spülen Sie die Schale 3 mal mit 1x PBS. Aspirieren Sie die PBS und permeabilisieren Zellen in 1 ml von 0,01% Triton X-100 in PBS für 2 min. Spülen Sie die Schale 3 mal mit 1x PBS. Aspirieren Sie die PBS und Blockzellen in 1 ml von 10% NGS in PBS für 40 min. Spülen Sie die Schale 3 mal mit 1x PBS. Fügen Sie 1 L Kaninchen-Anti-Caspase-3-Primärantikörper zu 1 ml 1% NGS in PBS hinzu (1:1000 Verdünnung). PBS aus der Schale aspirieren und durch die primäre Antikörperlösung ersetzen. Auf einen Shaker legen und 1,5 h bei RT inkubieren. Spülen Sie die Schale 3 mal mit 1x PBS. Fügen Sie 1 L Ziegen-Anti-Kaninchen AlexaFluor 488 Sekundärantikörper zu 1 ml von 1% NGS in PBS (1:1000 Verdünnung) hinzu. PBS aus der Schale aspirieren und durch die sekundäre Antikörperlösung ersetzen. Auf einen Shaker legen und 1 h bei RT inkubieren. Vorwärts bewegen die Proben vor Licht schützen. Spülen Sie die Schale 3 mal mit 1x PBS. Wiederholen Sie die Schritte 8.7 – 8.10, aber verwenden Sie den Hähnchen-Anti-TH-Primärantikörper (1:1000) in Schritt 8.7 und den Ziegenanti-Huhn AlexaFluor 594 Sekundärantikörper (1:1000) in Schritt 8.9. Legen Sie nach der abschließenden PBS-Spülung 30 L Montagemedium auf ein Mikroskopschlitten. Mit Zangen greifen Sie einen Deckelrutsch aus der 35 mm Petrischale und legen Sie den Deckelschlupf mit den Zellen nach unten in das Montagemedium. Beide Abdeckungen passen auf ein einziges Mikroskopschlitten, wenn sie richtig platziert sind. In einem trockenen, dunklen Bereich aufstellen und das Montagemedium über Nacht trocknen lassen. 9. Konfokale Bildgebung immunobefleckter Kulturen Konfokale Bildgebung Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware. Legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Mit dem Mikroskop Okularen, mit einem 20-fachen Vergrößerungsobjektiv und Epifluoreszenzlicht mit einem TRITC-Filter, fokussieren Sie die Probe und suchen Sie nach einem TH+ Zellkörper. Nachdem Sie einen TH+-Zellkörper gefunden haben, zentrieren Sie ihn im Sichtfeld, und bewegen Sie sich dann zum 60-fachen Vergrößerungsziel. Wählen Sie die Farbstoffe AlexaFluor 488 und AlexaFluor 594 im Fenster “Farbstoffliste”. Wie bei der Live-Bildgebung beginnen Sie mit niedrigen HV-, Gain-, Offset- und Laserleistungseinstellungen, um Photobleichungen zu verhindern. Verwenden Sie die Scanoption “Fokus x2”, um die fluoreszierende Intensität jedes Kanals zu bewerten und entsprechend anzupassen. Da diese Bilder später auf die fluoreszierende Intensität quantifiziert werden, ist es notwendig, die Bildgebungseinstellungen in allen Sichtfeldern konsistent zu halten. Daher ist es am besten, ein paar Beispiele für jede Bedingung zu betrachten, um eine Vorstellung von der Bandbreite der fluoreszierenden Intensität über Proben hinweg zu erhalten. Sobald die idealen Bildeinstellungen ermittelt wurden, wählen Sie die Scanoption “Fokus x2” aus und verschieben Sie die gewünschte Zelle in die Mitte des Sichtfeldes. Erhöhen Sie den digitalen Zoom mit dem Schieberegler “Zoom” auf das 3-fache. Mit dem Fokusknopf finden Sie die Fokusebene mit der hellsten Fluoreszenz und erfassen Sie ein einzelnes XY-Bild. Speichern Sie das Bild, um es zu beenden. Wechseln Sie zurück zum 20-fachen Vergrößerungsziel, um nach einer anderen TH+-Zelle zu suchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Zellen aus jeder Bedingung abgetastet wurde. Bildanalyse Klicken Sie in der ImageJ-Symbolleiste auf Analysieren | Legen Sie Messungenfest, und wählen Sie die Felder für Fläche, integrierte Dichte und mittleren Grauwert aus. Öffnen Sie ein Bild als Hyperstack mit jedem Kanal getrennt durch Ziehen und Ablegen in die ImageJ-Symbolleiste oder auswählen Sie das Bild über das Dateimenü. Verwenden Sie den TH-Kanal (594 nm), um ROIs um den Zellkörper zu zeichnen. Verfolgen Sie mit dem Polygonverfolgungswerkzeug in ImageJ den äußeren Rand des Zellkörpers genau nach. Wenn der Abstand zwischen Zellmembran und Zellkern der kleinste ist, verfolgen Sie eine gerade Linie durch das Zytosol bis zum Rand des Zellkerns und folgen Sie dann genau der Umrisslinie des Zellkerns, um ihn auszuschließen. Verfolgen Sie dann eine gerade Linie zurück zur äußeren Membran, die so eng wie möglich an die Anfangslinie grenzt, und folgen Sie weiterhin der Umrisslinie des Zellkörpers, bis der ROI abgeschlossen ist. Verwenden der Tastenkombination “T” oder über den Symbolleistenmenüpfad Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager, öffnen Sie den ROI-Manager und fügen Sie den ROI hinzu, der gerade zur Liste gezeichnet wurde. Wählen Sie das Fenster des caspase-3-Kanals (488 nm) und dann den zusätzlichen ROI in der Liste “ROI Manager” aus. Wählen Sie im Fenster ROI Manager die Schaltfläche Messen aus. Das Ergebnisfenster wird mit den zuvor festgelegten Messungen angezeigt. Kopieren Sie diese in eine Kalkulationstabelle, und wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle.