Quantifying Spontaneous Ca²⁺ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dierlijk veel onderwerpen zijn goedgekeurd door deth Texas A & M University Institutional Animal Care and Use Committee (25 november 2019; AUP# 2019-0346). OPMERKING: Voorbereiding van celkweekoplossingen moet gebeuren met behulp van steriele procedure in een biologische veiligheidskast en gefilterd op 0,2 μm om besmetting te voorkomen. 1. Voorbereiding van oplossingen en cultuurmedium Bereid de lamininecoatingoplossing voor door 20 μL van 1 mg/mL lamininebouillon te verdunnen tot 2 mL steriel gedistilleerde H2O. Bereid je op de dag van de ontleding voor. Bereid 10% paarden (paarden)serum (ES) stopoplossing voor door 5 mL ES toe te voegen aan 45 mL van 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij 4 °C. Bereid 4% runderserum albumine (BSA) voorraadoplossing voor door 2 g BSA-poeder toe te voegen aan 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en tot een eindvolume van 45 mL te brengen. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij 4 °C. Bereid papaïne voorraad oplossing door het verdunnen van papaïne tot 3 mg/mL in 1x HBSS. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C. Bereid deoxyribonuclease (DNase) oplossing door 20 mg DNase poeder toe te voegen aan steriele H2O en breng naar een uiteindelijk volume van 20 mL. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C. Bereid ascorbine zuurvoorraad oplossing door het toevoegen van 352 mg ascorbinezuur aan steriel gedistilleerde H2O en brengen tot een eindvolume van 20 mL. Verwarm in 37 °C bad op te lossen indien nodig. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem of spuitfiltertip. Bewaar bij -20 °C. Bereid Cell Culture Medium voor door het volgende toe te voegen aan 50 mL neurobasaalmiddel: 500 μL Glutamax (100x), 500 μL paardenserum, 1 mL B-27, 100 μL ascorbinezuur, 500 μL penicilline-streptomycine, 50 μL kanamycine en 50 μL ampicilline. Steriel filter met behulp van een 0,2 μm filtersysteem. Bewaar bij 4 °C. Bereid 0,01% Triton X-100-oplossing voor door 1 mL Triton X-100 toe te voegen aan 9 mL 1x PBS om een 10% oplossing te maken. Als Triton X-100 is stroperig, pipet langzaam om tip volledig te vullen. Verwarm in 37 °C bad op te lossen indien nodig. Bewaar bij 4 °C. Om 10% Triton X-100 aandelen te verdunnen tot 0,01%, voer 3 seriële 1:10 verdunningen uit. Verdun 1 mL van 10% voorraad in 9 mL van 1x PBS om 1% oplossing te maken. Verdun 1 mL van 1% oplossing tot 9 mL van 1x PBS om 0,1% oplossing te maken. Verdun 1 mL van 0,1% oplossing tot 9 mL van 1x PBS om een 0,01% oplossing te maken. Bereid 10% en 1% normale geitenserum (NGS) oplossing door 1 mL NGS toe te voegen aan 9 mL 1x PBS voor een 10% oplossing. Voeg 100 μL NGS toe aan 9,9 mL 1x PBS om 1% oplossing te maken. Bereid glutamaat stock oplossing (100 mM) door toevoeging van 735 mg L(+)-Glutamic zuur aan steriel gedistilleerde H2O en breng tot een eindvolume van 50 mL. Oplosbaarheid bij deze concentratie zal een probleem zijn. Het toevoegen van kleine volumes (100 μL) van 1 M zoutzuur is voldoende om de oplosbaarheid te verhogen. Bereid de NBQX-voorraadoplossing (10 mM) voor door 50 mg NBQX toe te voegen aan steriel gedistilleerde H2O en breng tot een eindvolume van 13 mL. 2. Bereiding van cultuurgerechten en coverslips (De dag voor ontleding gedaan) OPMERKING: We hebben ontdekt dat het combineren van drie coatingmiddelen, poly-L-lysine, poly-L-ornithine en laminine zorgt voor een ideale celhechting en levensvatbaarheid. Plaats 10 35 mm petrischaaltjes in een biologische veiligheidskast. Plaats twee cirkelvormige 12 mm coverslips in elk gerecht en vul met 70% EtOH gedurende 10 minuten. Gebruik een vacuümlijn om de resterende EtOH van elk gerecht aan te trekken, waardoor de EtOH volledig kan verdampen. Pipette ~90-100 μL van 0,1% poly-L-lysine oplossing op elke coverslip, ervoor te zorgen dat de gehele coverslip wordt gedekt door de poly-L-lysine oplossing. Bedek de gerechten met deksels en plaats in een couveuse van 37 °C voor 1 uur. Aspiraat resterende poly-L-lysine oplossing van elke coverslip en spoel met steriele H2O. Herhaal stap 2.2 – 2.3 met 0,1% poly-L-ornithine oplossing. Nogmaals, herhaal stappen 2.2 – 2.3 met 0,01% laminine oplossing. Plaats in een CO2-incubator van 37 °C/5% tot de volgende dag klaar is voor celbeplating. 3. Embryonale dissecties van muizen OPMERKING: We gebruiken tussen de 4 en 6 getimede zwangere muizen per cultuur. Hoewel een groot deel van het dissectieproces plaatsvindt buiten een biologische veiligheidskast is het nog steeds belangrijk om steriele procedure te handhaven. Overvloedig gebruik van 70% EtOH op oppervlakken in de buurt van de dissectiemicroscoop en op chirurgische hulpmiddelen is ideaal. Een masker kan ook worden gedragen tijdens de dissectie om besmetting verder te voorkomen. Daarnaast gebruiken we 4 afzonderlijke antibiotica in het kweekmedium, dus besmetting is onwaarschijnlijk. Echter, als het gebruik van antibiotica problematisch is, kan deze dissectie-setup worden verplaatst in een steriele kap. Om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, moeten alle ontledingsoplossingen bij 4 °C worden voorgekoeld en moeten dissecties zo snel mogelijk worden voltooid. We voeren de dissecties niet uit op ijs. De methode voor dissectie van embryonale midbrainneuronen van muizen is identiek aan eerder beschreven methoden9,10. Bereid een ruimte op een bank in de buurt van een dissectie microscoop met een absorberende pad en spray royaal met 70% EtOH. Spray twee 100 x 15 mm glazen petrischaaltjes en één 50 x 10 mm glazen petrischaal met 70% EtOH en laat EtOH verdampen. Eenmaal verdampt, plaats 50 mL steriele 1x HBSS in elk 100 x 15 mm petrischaaltje. Dompel chirurgische schaar, tangen en microtomeblad in 70% EtOH voor 10 min minimum te steriliseren. Plaats instrumenten op de absorberende pad te drogen. Met behulp van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie, euthanaseren 2-3 maanden oude getimede zwangerschap muizen op embryonale dag 14. Spray de buik van de geëuthanaseerde muizen met 70% EtOH. Met behulp van tangen pak de onderbuik en open de buikholte met behulp van chirurgische schaar. Begin te snijden in de buurt waar de tangen houden de buik, het maken van laterale bezuinigingen aan elke kant totdat de buikwand kan worden teruggevouwen en de baarmoeder is duidelijk zichtbaar. Met behulp van chirurgische schaar, snijd beide uiteinden van de baarmoeder hoorn. Verwijder vervolgens de baarmoeder en plaats in petrischaaltje met 1x HBSS. Met behulp van straight-tip tang voorzichtig verwijderen embryo’s uit de baarmoeder. Laat embryo’s in HBSS gedurende dit proces. Met behulp van de tang of een microtome mes, snel onthoofden embryo’s door te snijden in de buurt van de nek. Het maken van een zo vlak mogelijk snede. Verplaats onder een ontledenmicroscoop een embryokop naar een droge petrischaal van 50 mm en plaats aan de ventrale kant. Stabiliseer het hoofd met tangen door het plaatsen en penetreren in de buurt van de ogen / snuit. Tangen moeten naar beneden worden gekanteld op ~ 45° om te voorkomen dat de mesencephalon wordt doordringt. Verwijder met behulp van de tangen in de andere hand voorzichtig de doorschijnende laag huid en schedel net voor de prominente nok van de mesencephalon. Begin in de buurt van de middellijn en verwijder huid en schedel caudally totdat de mesencephalon volledig is blootgesteld. Houd de tang loodrecht op de blootgestelde mesencephalon met een punt tussen de cortex en mesencephalon en de andere in de buurt van het cerebellum. Druk naar beneden en knijp de tangen samen om de hele midbrain te verwijderen. Het middenbreinsegment moet ongeveer 0,5 mm dik zijn. Plaats het middenhersenensegment in de tweede petrischaal gevuld met verse 1x HBSS. Herhaal dit proces voor elk embryo. Met behulp van de dissectie microscoop, plaats de hersenen segment met de ventrale kant naar boven. Als de hersenvliezen nog steeds zijn bevestigd, verwijder het voorzichtig door te grijpen met de tangen en het optillen en uit de buurt van de hersenen segment. Het hersensegment moet 4 zichtbare kwadranten hebben. Plaats het segment zodanig dat de twee kleinere kwadranten superieur zijn geplaatst aan de twee grotere kwadranten. Er is een prominente nok die de superieure twee (kleine) kwadranten scheidt van de inferieure twee (grote) kwadranten. Met behulp van de tang knijpen en scheiden van de superieure kwadranten van de inferieure kwadranten, en vervolgens gooi de superieure kwadranten. De resterende inferieure kwadranten zullen teveel weefsel lateraal aan de rugkant hebben, dit weefsel zal er minder ondoorzichtig uitzien dan het resterende ventrale weefsel. Verwijder het minder dichte rugweefsel en gooi het weg. Het resterende segment moet zowel de Substantia nigra pars compacta (SNc) als het ventrale tegmental gebied (VTA) bevatten. Met behulp van de tangen snijd de resterende ventrale weefsel segment in 4 kleinere stukken en met behulp van een 1mL brede boring pipet overdracht van deze segmenten in een 15 mL conische buis met 1x HBSS. Houd de conische buis met hersensegmenten op ijs gedurende de procedure. Herhaal dit proces voor alle resterende hersensegmenten. 4. Dissociatie van cellen Enzymatische vertering van cellen De HBSS voorzichtig aanzuigen uit de 15 mL conische buis met middenhersenensegmenten, waardoor de segmenten aan de onderkant van de buis achterblijven. Voeg ~800 μL papaïneoplossing toe aan de buis en plaats 7 minuten in een couveuse van 37 °C. Resuspend cellen door het vegen van de buis en te vervangen aan de 37 °C incubator voor een extra 7 min. Verwijder met een breedborend 1 mL pipetpunt alleen de midbrainsegmenten in een 1 mL aliquot van DNase. Laat de segmenten de onderkant van de aliquot of ongeveer 1 min blootstelling bereiken. Verwijder met een breedborend 1 mL pipetpunt alleen de middenhersenensegmenten in een 15 mL conische buis met 2 mL stopoplossing. Laat segmenten zich aan de onderkant van de buis nestelen en herhaal de spoeling in een extra conische buis gevuld met stopoplossing. Mechanische trituratie van celsuspensie In de tweede stopoplossing spoelbuis, met behulp van een wide-bore 1 mL pipet tip, pipette de cellen op en neer 10 keer totdat er geen grote weefsel segmenten zichtbaar. Het is belangrijk om te voorkomen dat over trituratie voor minimale cellyse. Langzaam pipette 300 μL van 4% BSA oplossing aan de onderkant van de 15 mL conische buis met hersensegmenten. Verwijder voorzichtig de pipetpunt om een ophanglaag te behouden. Centrifuge op 0,4 x g gedurende 3 min. Vervolgens zorgvuldig aspirate de supernatant en resuspend cellen in 400 μL van celkweek medium. 5. Plating van de cellen OPMERKING: Op basis van ervaring worden ongeveer 100.000 levensvatbare cellen per embryo verzameld. 2-3 maanden oude getimede zwangere muizen hebben meestal nestgroottes van 8-10 embryo’s; daarom is een ruwe schatting voor de totale opbrengst van cellen per getimede zwangere muis ongeveer 1 miljoen cellen. Met behulp van een hemocytometer preform een cel telling en vervolgens verdunnen van de schorsing tot 2.000 cellen / μL met behulp van celkweek medium. Trituraat kort te mengen. Verwijder de hoezen met laminineoplossing uit stap 2 uit de couveuse en zuig de resterende laminineoplossing met behulp van een vacuüm uit de gecoate covers. Plaat snel om te voorkomen dat de covers niet volledig drogen. Pipette 100 μL (2,0 x 105 cellen/coverslip) op elke coverslip en plaatst petrischaaltjes in een couveuse van 37 °C voor 1 uur. Voeg voorzichtig 3 mL celkweekmedium toe aan elk gerecht en plaats terug in de 37 °C incubator. Preform half medium verandert 2 keer per week gedurende 2 weken. 6. Infectie van de celcultuur bij 14 DIV met adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren Bereid voor elk gerecht 1 mL serumvrij DMEM-medium met 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titer) Aspirate de cel cultuur medium van elk gerecht en vervangen door 1 mL serum vrije DMEM met hSyn-GCaMP6f. Plaats de gerechten 1 uur terug in de 37 °C couveuse. Aspirate het serumvrije medium met AAV’s en vervang het door 3 mL celkweekmedium. Plaats de gerechten terug in de 37 °C couveuse. We hebben ontdekt dat 5-7 dagen van AAV-infectie zorgt voor ideale niveaus van GCaMP expressie. Blijf medium elke 2-3 dagen veranderen gedurende deze periode van virale infectie. 7. Live confocale Ca2+ beeldvorming tussen 19-21 DIV OPMERKING: Zoals vermeld in stap 6.3, beeldvorming kan worden gedaan tussen 5-7 dagen na virale infectie. Dit is het ideale venster om zichtbare expressie van de fluorofophore te bereiken op niveaus die het mogelijk maken om spontane Ca2+ activiteit te detecteren. Voorbereiding van de registratiebuffers Om 1 L HEPES-opnamebuffer te maken, voegt u toe: 9.009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glucose, 2,381 g HEPES, 2 mL van 1 M CaCl2-voorraadoplossing en 500 μL van 1 M MgCl2-voorraadoplossing tot 800 mL steriel gedistilleerd H2O. Breng de pH naar 7,4 met NaOH. Breng naar een laatste volume van 1 L. Om 200 mL glutamaat opnamebuffer van 20 μM te maken, verdunt u 40 μL van 100 mM glutamaatvoorraadoplossing tot 200 mL HEPES-opnamebuffer zoals hierboven beschreven. Om 200 mL nbqx-opnamebuffer van 10 μM NBQX te maken, verdunt u 200 μL van 10 mM NBQX voorraadoplossing tot 200 mL HEPES-opnamebuffer. Confocale beeldvorming Vul een steriele petrischaal van 35 mm met 3 mL opnamebuffer. Haal een petrischaaltje van 35 mm met besmette culturen uit de 37 °C couveuse. Met behulp van fijne tip tangen, zorgvuldig pak de rand van een coverslip en breng het snel in de petrischaal gevuld met opnamebuffer. Plaats de resterende coverslip in medium back in de 37 °C incubator. Transporteren van de schotel met opnamebuffer naar de confocale microscoop. Start de beeldsoftware. Ga naar de volgende stap terwijl het initialiseert. Start de peristaltische pomp en plaats de lijn in de opnamebuffer. Kalibreren van de snelheid van de stroom te zijn 2 mL/min. Breng de besmette coverslip van de 35 mm Petri schotel in het opnamebad. Met behulp van de 10x water onderdompeling doelstelling en BF licht, vind het vlak van focus en kijk voor een regio met een hoge dichtheid van neuron cel lichamen. Schakel over naar de 40x wateronderdompelingsdoelstelling en richt het monster met behulp van BF-licht opnieuw. Selecteer AlexaFluor 488 in het venster ‘Lijst met kleurstoffen’ in FluoView en pas deze toe. AAV-expressie kan variabel zijn; daarom, om overbelichting en fotobleaching van de fluoroforen te voorkomen, beginnen met lage HV en laser vermogen instellingen. Voor de AlexaFluor 488 kanaal, zet de hoogspanning (HV) op 500, de winst op 1x, en offset op 0. Voor de 488 laserlijn zet het vermogen op 5%. Om het effectieve volume in het z-vlak te verhogen, verhoogt u de pinholegrootte tot 300 μm. Gebruik de scanoptie “focus x2” om emissiesignalen optimaal aan te passen aan subverzadigingsniveaus. Vanaf hier kunnen instellingen worden aangepast tot de ideale zichtbaarheid van elk kanaal is bereikt.OPMERKING: Om het volledige bereik van Ca2+ fluxen nauwkeurig vast te leggen met GCaMP, past u de instellingen voor baseline HV en laservermogen aan om een toename van de fluorescerende intensiteit mogelijk te maken zonder de detector te oververzadigen. Zodra microscoop instellingen zijn geoptimaliseerd, verplaatsen van het stadium om een regio met meerdere cellen met spontane veranderingen in GCaMP6f fluorescentie en zich richten op het gewenste vlak voor beeldvorming te lokaliseren. Gebruik het gereedschap ‘Clip rect’ om het beeldframe te knippen tot een grootte die een frameinterval van iets minder dan 1 seconde kan bereiken. Dit is nodig om het beeldinterval in te stellen op 1 frame per seconde. Stel het venster Interval in op een waarde van 1,0 en het venster ‘Num’ op 600.OPMERKING: Om verschillende opnamebuffers op het gewenste tijdpunt (300 s) te leveren, is het belangrijk om de latentie van de pomp te kalibreren om de nieuwe oplossing aan het bad te leveren. Dit is afhankelijk van de oplossingsperfusiesnelheid (2 mL/min) en de lengte van de lijn die wordt gebruikt om de oplossing te pompen. Als u een film uit de T-serie wilt vastleggen, selecteert u de optie ‘Tijd’ en gebruikt u de scanoptie ‘XYt’ om te beginnen met beeldvorming. Bekijk de voortgangsbalk van de beeldvorming en verplaats de lijn van de HEPES-opnamebuffer naar de 20 μM glutamaat opnamebuffer op het juiste tijdstip (bijvoorbeeld als de latentie van de pomp is gekalibreerd om de oplossing bij 60 s te leveren, verplaats de lijn in de glutamaatbuffer bij 240 frames om glutamaat bij 300 s te leveren). Wanneer de beeldvorming is voltooid, selecteert u de knop Series Gereed en slaat u de voltooide film uit de T-serie op. Blijf 20 μM Glutamaat gedurende nog eens 5 minuten doornemen, zodat de gekweekte neuronen in totaal 10 minuten aan glutamaat zijn blootgesteld. Herhaal dit proces voor elke coverslip te worden afgebeeld. Na de extra 5 minuten blootstelling aan 20 μM Glutamaat, verwijder de coverslip uit het bad en plaats terug in de 35mm Petri schotel met opnamebuffer tot de dag van beeldvorming is voltooid. Ga na afloop door naar stap 8. Ca2+ traceanalyse Beeldanalyse uitvoeren in ImageJ. Installeer de BIO-FORMATS plugin voor ImageJ, die het mogelijk maakt . OIB-afbeeldingsbestanden openen. Klik op de werkbalk ImageJ op Analyseren | Stel Metingen inen selecteer het vak voor Gemiddelde grijze waarde (MGV). Open in ImageJ een film uit de T-serie als hyperstack. Sleep de schuifregelaar voor de film en identificeer het frame met maximale glutamaatrespons om alle neuronen die reageren op glutamaat te visualiseren. Gebruik de polygoon tool om alle zichtbare neuron cel lichamen te traceren, het toevoegen van hun ROI’s aan de “ROI manager” lijst. Wanneer u klaar bent met het traceren en toevoegen van ROI’s, selecteert u alle ROI’s binnen het venster ROI Manager en gebruikt u de selectie voor meerdere metingen in de meer lijst met opties. Kopieer en plak deze gegevens in een spreadsheet. Voltooi dit proces voor alle films die moeten worden geanalyseerd. Zet voor elke ROI de ruwe MGV-gegevens van elk frame om naar ΔF/F0-waarden met behulp van de vergelijking: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Waar F(t) = MGV van een bepaald frame, en F0 = gemiddelde baseline MGV van ~ 10 frames waar geen Ca2 + fluxen aanwezig zijn. Met behulp van een statistische software zoals OriginPro 2020 kunnen omgezette ΔF/F0-sporen worden omgezet in lijngrafieken. De functie “Peak analyzer” kan worden gebruikt (of een soortgelijke functie als u een andere software gebruikt) om de piekamplitude van glutamaatrespons, latentie om te reageren op glutamaat en gebied onder de curve te meten. 8. Immunostaining van culturen LET OP: Na fixatie met formaline kunnen coverslips worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 °C totdat ze klaar zijn om te worden verwerkt voor immunostaining. Primaire en secundaire antilichaam incubatie werd gedaan op een seriële manier, als zodanig incubatie met anti-Caspase-3 primaire antilichaam en de complementaire secundaire antilichaam voorafgegaan incubatie met de anti-TH primaire antilichaam en de complementaire secundaire antilichaam. Onmiddellijk na glutamaat blootstelling, plaats de coverslip terug in zijn 35 mm petrischaal, aspirate de opname buffer, en voeg 3 mL van 10% formaline. Laat zitten voor 40 minuten op kamertemperatuur (RT). Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS. Aspirate de PBS en permeabiliseren cellen in 1 mL van 0,01% Triton X-100 in PBS gedurende 2 min. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS. Aspirate de PBS en blokcellen in 1 mL van 10% NGS in PBS gedurende 40 min. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS. Voeg 1 μL konijn anti-Caspase-3 primair antilichaam toe aan 1 mL van 1% NGS in PBS (1:1000 verdunning). Aspirate PBS uit de schotel en vervangen door de primaire antilichaam oplossing. Plaats op een shaker en incubeer voor 1,5 uur op RT. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS. Voeg 1 μL geitenantikonijn AlexaFluor 488 secundair antilichaam toe aan 1 mL van 1% NGS in PBS (1:1000 verdunning). Aspirate PBS uit de schotel en vervangen door de secundaire antilichaam oplossing. Plaats op een shaker en incubbate voor 1 uur op RT. Moving forward bescherm de monsters tegen licht. Spoel de schotel 3 keer af met 1x PBS. Herhaal stappen 8.7 – 8.10, maar met behulp van de kip anti-TH primaire antilichaam (1:1000) in stap 8.7 en de geit anti-kip AlexaFluor 594 secundaire antilichaam (1:1000) in stap 8.9. Na de laatste PBS-spoeling plaatst u 30 μL montagemedium op een microscoopdia. Pak met tangen een hoezenlip van de 35 mm Petrischaal en plaats de coverslip met de cellen naar beneden in het montagemedium. Beide coverslips passen op een enkele microscoopplaat als deze correct wordt geplaatst. Plaats in een droge, donkere ruimte en laat het montagemedium ‘s nachts drogen. 9. Confocale beeldvorming van immunosidrische culturen Confocale beeldvorming Start de beeldsoftware. Plaats het monster op het microscooppodium. Met de microscoop oculairs, met behulp van een 20x vergroting doelstelling en epifluorescent licht met een TRITC filter, focus het monster en zoeken naar een TH + cel lichaam. Zodra het lokaliseren van een TH + cel lichaam, centreren in het gezichtsveld en ga dan naar de 60x vergroting doelstelling. Selecteer de AlexaFluor 488 en AlexaFluor 594 kleurstoffen in het venster “kleurstoflijst”. Net als bij live imaging, beginnen met lage HV, gain, offset, en laser power instellingen om te voorkomen dat fotobleaching. Gebruik de scanoptie “focus x2” om de fluorescerende intensiteit van elk kanaal te beoordelen en dienovereenkomstig aan te passen. Aangezien deze beelden later worden gekwantificeerd voor fluorescerende intensiteit is het noodzakelijk om de beeldvormingsinstellingen consistent te houden in alle gezichtsvelden. Daarom is het het beste om te kijken naar een paar voorbeelden van elke aandoening om een idee te krijgen van het bereik van fluorescerende intensiteit over monsters. Zodra de ideale beeldvormingsinstellingen zijn bepaald, selecteert u de scanoptie ‘focus x2’ en verplaatst u de cel van belang naar het midden van het gezichtsveld. Verhoog de digitale zoom tot 3x met de schuifregelaar ‘zoomen’. Met behulp van de focusknop, vind het vlak van focus met de helderste fluorescentie en leg een enkel vlak XY beeld. Sla de afbeelding op om te voltooien. Schakel terug naar de 20x vergroting doelstelling om te zoeken naar een andere TH + cel. Herhaal dit proces totdat het gewenste aantal cellen van elke voorwaarde is bemonsterd. Beeldanalyse Klik op de werkbalk ImageJ op Analyseren | Stel Metingen inen selecteer de vakken voor Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde. Open een afbeelding als een hyperstack met elk kanaal gescheiden door te slepen en te laten vallen in de ImageJ werkbalk of het selecteren van de afbeelding via het menu van het bestand. Gebruik het TH-kanaal (594 nm) om ROI’s rond het cellichaam te tekenen. Met behulp van het gereedschap veelhoektracering in ImageJ traceert u de buitenrand van het cellichaam nauwkeurig. Waar de afstand tussen het celmembraan en de celkern de kleinste is, traceer dan een rechte lijn door de cytosol naar de rand van de kern en volg vervolgens de omtrek van de kern op de voet om deze uit te sluiten. Traceer vervolgens een rechte lijn terug naar het externe membraan, grenzend aan de eerste lijn zo dicht mogelijk, en blijven de contouren van de cel lichaam te volgen totdat de ROI is voltooid. Met behulp van de sneltoets “T” of met behulp van de werkbalk menu pad Analyseren | Hulpmiddelen | ROI Manager, open de ROI manager en voeg de ROI die net werd aangetrokken tot de lijst. Selecteer het venster van het caspase-3-kanaal (488 nm) en selecteer vervolgens de toegevoegde ROI in de lijst ‘ROI Manager’. Selecteer in het venster ROI Manager de knop Meten. Het resultatenvenster wordt weergegeven met de metingen die eerder zijn ingesteld. Kopieer deze naar een spreadsheet en herhaal dit proces voor elke cel.