Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

Il riciclo dell’acqua nelle aziende agricole e negli asili nido sta diventando sempre più popolare a causa dell’aumento dei costi dell’acqua e delle preoccupazioni ambientali alla base dell’utilizzo dell’acqua. Molti metodi di irrigazione sono stati sviluppati per i coltivatori per ridurre la diffusione e l’insorgenza di malattie vegetali. Indipendentemente dalla fonte dell’acqua (irrigazione o precipitazioni), viene generato il deflusso, e molti coltivatori di ortaggi e vivaio hanno uno stagno per raccogliere e riciclare il^{deflusso 1}. Questo crea un serbatoio per un possibile accumulo di agenti patogeni favorendo la diffusione di agenti patogeni quando l’acqua riciclata viene utilizzata per irrigare le^{colture 2,3,4}. Gli agenti patogeni delle piante di oomicete beneficiano particolarmente di questa pratica in quanto gli zoospore si accumulano in acqua e la spore dispersiva primaria è auto-motile ma richiede^{acqua superficiale 5,6,7}. Phytophthora capsici è un agente patogeno oomicete che colpisce un numero significativo di colture di conforto e cucurbit in modi diversi⁸. Spesso, i sintomi sono smorzamento-off di piantine, radice e marciume corona; tuttavia, in colture come cetriolo, zucca, melone, zucca, anguria, melanzane e pepe, interi raccolti possono essere persi a causa del marciume^{della frutta 9}. Anche se ci sono metodi noti per rilevare questo agente patogeno della pianta, la maggior parte richiedono un’infezione che è già avvenuta che è troppo tardi per eventuali fungicidi preventivi per avere un effetto^{significativo 10}.

Il metodo tradizionale per testare l’acqua di irrigazione per il rilevamento e la diagnosi di microrganismi mirati è un approccio antiquato quando velocità e sensibilità sono cruciali per il successo e la produzione di colture^{redditizie 11,12}. Il tessuto vegetale suscettibile all’agente patogeno mirato (ad esempio, melanzane per P. capsici)è attaccato a una trappola modificata che viene sospesa in uno stagno di irrigazione per un periodo prolungato prima di essere rimosso e ispezionato per l’infezione. I campioni del tessuto vegetale vengono poi placcati su supporti semi-selettivi (PARPH) e incubati per la crescita della coltura, quindi l’identificazione morfologica viene eseguita utilizzando un microscopio^{composto 13}. Ci sono altri metodi di rilevamento simili per altri agenti patogeni vegetali che utilizzano supporti selettivi e placcano piccole quantità di acqua contaminata prima di sub-culturing^14,15. Questi metodi richiedono da 2 a 6 settimane, diversi cicli di sub-culturing per isolare l’organismo, e l’esperienza sulla diagnostica Phytophthora per essere in grado di riconoscere i caratteri morfologici chiave di ogni specie. Questi metodi tradizionali non funzionano bene per il rilevamento dell’acqua di irrigazione contaminata da P. capsici a causa di fattori come l’interferenza di altri microrganismi che sono presenti anche nelle fonti d’acqua. Alcuni microrganismi in rapida crescita come Pythium spp. e batteri a base d’acqua possono sovracrescere sulla piastra rendendo P. capsici inosservabile^16,17.

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo molecolare sensibile e specifico che possa essere utilizzato sia in campo che in laboratorio per rilevare gli zoospori P. capsici nell’acqua di irrigazione. Il protocollo include lo sviluppo di un nuovo set di primer LAMP (IOthermal amplification) mediato a ciclo continuo in grado di amplificare specificamente P. capsici, basato su un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici^18,19. Un primer LAMP sviluppato in precedenza da Dong et al. (2015) è stato utilizzato in confronto al saggio che è stato sviluppato per questo studio²⁰.

Il test LAMP è una forma relativamente nuova di rilevamento molecolare che è stato dimostrato di essere più rapida, sensibile e specifica rispetto alla reazione a catena polimerasi convenzionale (PCR)²¹. In generale, i saggi PCR convenzionali non sono in grado di rilevare meno di 500 copie (1,25 pg/L); al contrario, studi precedenti hanno dimostrato che la sensibilità di LAMP può essere da 10 a 1.000 volte superiore rispetto alla PCR convenzionale e può facilmente rilevare anche 1 fg/L di DNA genomico^22,23. Inoltre, il saggio può essere effettuato rapidamente (spesso in 30 min) e in loco (nel campo) utilizzando un blocco di riscaldamento portatile per l’amplificazione e un colorante colorimetrico che cambia colore per un campione positivo (eliminando la necessità di elettroforesi). In questo studio, abbiamo confrontato la sensibilità dei saggi PCR e LAMP utilizzando un metodo di estrazione del filtro. Il metodo di rilevamento proposto consente ai ricercatori e agli agenti di estensione di rilevare facilmente la presenza di spore P. capsici provenienti da diverse fonti d’acqua in meno di due ore. Il saggio è dimostrato di essere più sensibile rispetto al PCR convenzionale ed è stato convalidato in situ rilevando la presenza dell’agente patogeno nell’acqua di irrigazione utilizzata da un coltivatore. Questo metodo di rilevamento permetterà ai coltivatori di stimare la presenza e la densità di popolazione dell’agente patogeno in varie fonti d’acqua utilizzate per l’irrigazione, prevenendo focolai devastanti e perdite economiche.