Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

Переработка воды на фермах и в детских садах становится все более популярной в связи с ростом цен на воду и экологическими проблемами, связанными с использованием воды. Для производителей было разработано множество методов орошения для сокращения распространения и возникновения болезней растений. Независимо от источника воды (орошения или осадков), сток генерируется, и многие овощеводы и питомники имеют пруд для сбора и переработки стока¹. Это создает резервуар для возможного накопления патогенов в пользу распространения патогенных микроорганизмов, когда переработанная вода используется для^{орошения сельскохозяйственных культур 2,,3,,4.} Oomycete растительных патогенов особенно извлечь выгоду из этой^{практики,}как зооспоры будут накапливаться в воде и первичной диспергаторной споры является самодвижительным, но^{требует поверхностных вод 5},^6,7. Phytophthora capsici является патогеном oomycete, который влияет на значительное количество соланацезных и cucurbit культур по-разному⁸. Часто симптомы демпфирования-офф саженцев, корнеплодов и коронки гнили; однако, в таких культурах, как огурец, тыква, дыня, тыква, арбуз, баклажаны и перец, целые урожаи могут быть потеряны из-за фруктовой^{гнили 9}. Хотя Есть известные методы обнаружения этого патогена растений, большинство требуют инфекции уже имели место, которое слишком поздно для любых профилактических фунгицидов, чтобы иметь значительный^{эффект 10}.

Традиционный метод проверки оросительной воды для выявления и диагностики целевых микроорганизмов является устаревшим подходом, когда скорость и чувствительность имеют решающее значение для успеха и^{прибыльного производства сельскохозяйственных культур 11,,12}. Ткань растений, восприимчивая к целевому патогену (например, баклажаны для P. capsici) крепится к модифицированной ловушке, которая приостанавливается в оросительном пруду в течение длительного периода времени, прежде чем быть удалены и проверены на инфекцию. Образцы из растительной ткани затем помылись на полу селективных средств массовой информации (PARPH) и инкубируется для роста культуры, то морфологическая идентификация выполняется с помощью^{соединения микроскопа 13}. Есть и другие аналогичные методы обнаружения для других патогенных микроорганизмов растений с использованием селективных средств массовой информации и покрытие небольшое количество загрязненной^{воды до суб-культа 14,15}. Эти методы требуют от 2 до 6 недель, несколько раундов суб-культирования, чтобы изолировать организм, и опыт по фитофторы диагностики, чтобы иметь возможность распознавать ключевые морфологические символы каждого вида. Эти традиционные методы не работают хорошо для обнаружения оросительной воды, загрязненной P. capsici из-за таких факторов, как вмешательство других микроорганизмов, которые также присутствуют в источниках воды. Некоторые быстрорастущие микроорганизмы, такие как Pythium spp. и бактерии, передающие воду, могут разрастаться на пластине, делая P. capsici необнаружимым^16,,17.

Целью данного исследования была разработка чувствительного и специфического молекулярного метода, который может быть использован как в полевых, так и в лабораторных условиях для обнаружения зооспоров P. capsici в оросительной воде. Протокол включает в себя разработку нового цикла опосредованного изотермального усиления (LAMP) грунтовки набор, способный специально усилить P. capsici, на основе 1121-базовой пары (bp) фрагмент P. capsici^18,19. Ранее разработанная грунтовка LAMP от Dong et al. (2015) была использована по сравнению с анализом, который был разработан для этого исследования²⁰.

Анализ LAMP является относительно новой формой молекулярного обнаружения, которая была продемонстрирована как более быстрая, чувствительная и специфичная, чем обычная полимераза цепная реакция (PCR)²¹. В целом, обычные анализы ПЦР не могут обнаружить менее 500 копий (1,25 пг/ОЛ); в отличие от этого, предыдущие исследования показали, что чувствительность LAMP может быть от 10 до 1000 раз выше, чем обычные ПЦР и может легко обнаружить даже 1 fg/L геномной^{ДНК 22,23}. Кроме того, анализ может быть проведен быстро (часто в 30 мин) и на месте (в поле) с помощью портативного нагревательного блока для усиления и колоритетрического красителя, который меняет цвет для положительного образца (удаление необходимости электрофореза). В этом исследовании мы сравнили чувствительность анализов ПЦР и LAMP с помощью метода извлечения фильтра. Предлагаемый метод обнаружения позволяет исследователям и агентам расширения легко обнаружить наличие спор P. capsici из различных источников воды менее чем за два часа. Анализ оказался более чувствительным, чем обычные ПЦР и был проверен на месте, обнаружив наличие патогена в оросительной воде, используемой производителем. Этот метод обнаружения позволит производителям оценить наличие и плотность популяции патогена в различных источниках воды, которые используются для орошения, предотвращая разрушительные вспышки и экономические потери.