Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato
Summary
Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.
Abstract
Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.
Introduction
Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro oferece muitas vantagens, incluindo simplicidade na prática e avaliação, baixo custo na manutenção de linhas celulares em contraste com os animais e relativa facilidade em manipulações genéticas. No entanto, a eficiência e a qualidade dos tipos de células diferenciadas são frequentemente afetadas por diferentes linhas de mESCs, bem como pelos métodos de diferenciação5,6. Além disso, os ensaios tradicionais para avaliar a eficiência de diferenciação dependem do exame qualitativo de genes marcadores selecionados que carecem de robustez e, portanto, não conseguem compreender as mudanças globais na expressão genética.
Aqui pretendemos usar uma bateria de ensaios para avaliação sistemática da diferenciação neuronal. Utilizando ambas as análises in vitro tradicionais em marcadores selecionados e RNA-seq, estabelecemos uma plataforma para medição da eficiência de diferenciação, bem como as alterações transcriômicas durante este processo. Com base em um protocolo previamente estabelecido7,geramos corpos embrionários (EBs) através da técnica de queda suspensa, seguidos pela indução usando quantidade suprafisiológica de ácido retinóico (RA) para gerar células progenitoras neurais (NPCs), que foram posteriormente diferenciadas aos neurônios com meio de indução neural. Para examinar a eficiência da diferenciação, além dos ensaios tradicionais de RT-qPCR e imunofluorescência (IF), realizamos RNA-seq e citometria de fluxo. Essas análises fornecem uma medição abrangente da progressão da diferenciação específica do estágio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras difer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Riferimenti
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