التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس
Summary
نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.
Abstract
نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لزراعة وتمييج الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الأنساب العصبية، تليها سلسلة من المقايسات لتوصيف الخلايا المتمايزة. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأرة E14 لتشكيل أجسام جنينية من خلال طريقة الإسقاط المعلق ، ثم تم حثها على التفريق إلى خلايا السلف العصبي بواسطة حمض الريتينويك ، وتم تمييزها أخيرا إلى خلايا عصبية. كشفت تجارب النسخ العكسي الكمي البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) وتجارب immunofluorescence أن السلف العصبي والخلايا العصبية تظهر علامات المقابلة (نستين للسلف العصبية والتشخيص العصبي للخلايا العصبية) في اليوم 8 و 12 بعد التمايز، على التوالي. أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي على خط E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 أن حوالي 60٪ من الخلايا في اليوم 8 إيجابية GFP ، مما يشير إلى التمايز الناجح لخلايا السلف العصبي في هذه المرحلة. وأخيرا، استخدم تحليل الحمض النووي الريبي-seq لتحليل التغيرات العالمية في النسخ. هذه الأساليب مفيدة لتحليل مشاركة جينات ومسارات محددة في تنظيم انتقال هوية الخلية أثناء التمايز العصبي.
Introduction
منذ اشتقاقها الأول من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الكيسية الماوسالنامية 1،2، وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESC) كأدوات قوية لدراسة الخلايا الجذعية التجديد الذاتي والتمايز3. وعلاوة على ذلك، فإن دراسة التمايز mESC يؤدي إلى فهم هائل للآليات الجزيئية التي قد تحسن الكفاءة والسلامة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية في علاج أمراض مثل الاضطرابات العصبية4. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية، يوفر هذا النظام في المختبر العديد من المزايا بما في ذلك البساطة في الممارسة والتقييم، وانخفاض التكلفة في الحفاظ على خطوط الخلايا على النقيض من الحيوانات، وسهولة نسبية في التلاعب الجيني. ومع ذلك، فإن كفاءة وجودة أنواع الخلايا المتمايزة تتأثر في كثير من الأحيان بخطوط مختلفة من mESCs وكذلك طرق التفريق5و6. كما أن المقايسات التقليدية لتقييم كفاءة التمايز تعتمد على الفحص النوعي لجينات العلامات المختارة التي تفتقر إلى القوة، وبالتالي فهي تفشل في فهم التغيرات العالمية في التعبير الجيني.
هنا نهدف إلى استخدام بطارية من المقايسات لتقييم منهجي للتمايز العصبي. باستخدام كل من التحليلات التقليدية في المختبر على علامات مختارة ورنا-seq، ونحن إنشاء منصة لقياس كفاءة التمايز، فضلا عن التغيرات النسخية خلال هذه العملية. استنادا إلى بروتوكولالمنشأةسابقا 7 , أنشأنا الأجسام الجنينية (EBs) من خلال تقنية إسقاط شنقا, تليها التعريفي باستخدام كمية فوقفيزيولوجية من حمض الريتينويك (RA) لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs), التي تم تمييزها في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية مع وسيط التعريفي العصبي. لدراسة كفاءة التمايز ، بالإضافة إلى المقايسات التقليدية RT-qPCR والمناعة (IF) ، قمنا بإجراء قياس الخلايا الحمض النووي الريبي والتدفق. وتوفر هذه التحليلات قياسا شاملا لتطور التمايز الخاص بالمرحلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إنشاء طريقة التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس لعقود واستمر الباحثون في تعديل البروتوكولات السابقة أو إنشاء بروتوكولات جديدة لأغراض مختلفة7و10و11. استخدمنا سلسلة من المقايسات لتحليل شامل لكفاءة وتقدم مراحل التمايز من mESCs ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (1R35GM133496-01) إلى Z. Gao. نود أن نشكر الدكتور ريان هوبز على المساعدة في القسم. نشكر المرافق الأساسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب، بما في ذلك علوم الجينوم والمعلوماتية الحيوية، والتصوير المجهري الضوئي المتقدم، وقياس التدفق الخلوي. كما نشكر الدكتور يوكا إيمامورا على المساعدة في تحليل الحمض النووي الريبي.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Riferimenti
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
