유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

모든 절차는 국립 보건원의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고사항을 준수하고 동물과 관련된 생물 의학 연구를위한 국제 지침 원칙에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 샬럿 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 노스 캐롤라이나 대학에 의해 승인되었다 (프로토콜 #19-020). 1. 문화준비 참고: 이러한 절차는 조직 배양으로 지정된 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행해야 합니다. 미디어 및 솔루션에 대한 표 1을 참조하십시오. 자체 밀봉 살균 백에서 자동화하여 모든 해부 도구를 소독합니다. 12웰 문화 요리를 치료하기 위해 폴리 D-리신의 작업 주식을 준비합니다. 100 μg/mL(10배 농축)의 농도로 폴리-D-리신을 1배 붕산완충으로 용해한다. 필요할 때까지 -20°C에 약 1mL 알리쿼트저장하십시오. dPBS에서 10배 농축 폴리-D-리신을 10μg/mL(1x)으로 희석하고 필터 살균을 제거합니다. 12웰 배양판을 실온에서 1배 의 웰당 0.5mL로 처리하여 다음날 사용하기 위해 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 처리합니다. 폴리 D-리신의 부피가 문화 영역의 바닥을 완전히 덮기에 충분하도록 보장합니다. 사용하기 직전에 배양 판에서 폴리-D-리신을 제거하고 멸균 물에 3배 헹구고, 플레이트 셀에 준비될 때까지 멸균 물에 보관하십시오. 도금 세포 전에 철저한 포부로 액체의 모든 흔적을 제거하십시오. 뉴런 성장 미디어 및 FACS 버퍼를 준비합니다. 필터 살균 및 사용까지 4 °C에 저장합니다. 뉴런 성장 미디어는 약 2 wks에 대해 보관할 수 있습니다. FACS 버퍼는 약 4 wks에 대해 보관할 수 있습니다. 2. 배아 해마를 해부 참고: 이 절차는 해마의 수막 및 미세 절제거를 위한 스테레오 현미경의 사용을 필요로 하기 때문에 벤치탑에서 수행될 수 있습니다. 잠재적인 오염을 최소화하기 위해 엄격한 무균 기술을 준수하십시오. 18일CO2 챔버에서 배아의 날에 임신한 C57BL/6J 암컷 마우스를 안락사시한다. 복부 피부와 모피를 70% EtOH로 뿌린 다음, 조직 집게로 피부를 꼬집어 수술 가위로 작은 절개를 합니다. 궁수와 자궁을 노출하도록 회중을 절개합니다. 표준 패턴 집게로 자궁을 잡고, 캐비티에서 들어 올리고, 미세 한 가위로 심술통에 대한 연결을 잘라. 배아를 가진 자궁을 얼음 위에 놓는 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 옮습니다. 미세 한 가위와 미세 한 집게를 사용 하 여, 조심스럽게 자궁을 잘라 배아 주머니를 제거 배아를 방출. 배아를 얼음 위에 올려놓은 dPBS를 함유한 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 배아를 옮기. 미세 가위를 사용하여 참수 배아 새끼를 참수하고 얼음에 배치 된 최대 절전 모드 – E 매체를 포함하는 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 머리를 옮긴다. 뇌를 제거하려면 한 손에 미세 한 개의 집게로 머리를 잡습니다. 다른 한편으로는 구부러진 Dumont #7 집게를 사용하여 두개골 바닥에 집게 의 끝을 삽입하고 뼈를 꼬집어 뇌를 관통하지 않고 중간라인을 따라 앞쪽으로 움직이는 피부를 덮습니다. 구부러진 집게를 사용하여 피부와 두개골을 분리하여 뇌를 드러냅니다. 노출된 후각 전구에서 소뇌로 뇌 아래 구부러진 집게를 쓸어내고 두개골에서 뇌를 들어 올립니다. 얼음 위에 놓인 최대 절전 모드-E 배지를 함유한 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시에 뇌를 옮긴다. 각 뇌에 대해 반복합니다.참고: 실험별 목적으로 분리될 필요가 없는 한 모든 뇌는 단일 문화 접시에서 수집될 수 있습니다. 스테레오 해부 현미경에서, 한 번에 하나의 뇌와 멸균 Dumont #5 집게의 두 쌍으로 작업, 후각 전구를 꼬집어 수막을 당겨. 수막의 철저한 제거는 다른 세포에 의한 배양 오염을 피하고 추가 해부를 허용하기 위해 필요합니다. 수막이 제대로 제거되면 피질의 우수한 측면이 측면으로 열리면 해마가 노출됩니다. Dumont #5 집게를 사용하여 부착 된 피질에서 해마를 꼬집고 격리 된 해마를 얼음 위에 최대 절전 모드 – E 배지 5 mL이 들어있는 멸균 15 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 이송하십시오. 각 배아 마우스 새끼에 대한 두 뇌 반구에 대한 해부를 반복하고 실험 특정 목적을 위해 별도로 필요하지 않는 한 모든 해마를 단일 15 mL 원판 튜브로 결합하십시오. 피질 뉴런을 배양하기 위해 피질은 피질과 분리되어 해마 뉴런과 동일하게 처리될 수 있다.참고: 이 시점에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. B27로 보충된 최대 절전 모드에서 뇌 또는 해마를 저장합니다(2%) 최대 4°C에서 최대 1개월 동안 연장지연이 실행 가능한 세포의 수를 손상시킬 수 있다. 3. 해마 뉴런을 해리하고 배양 참고: 모든 절차는 생물 안전 캐비닛으로 지정된 조직 배양에서 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다. 해마 해리를 위해 배아당 0.5mL의 파아플 해리 용액을 준비한다. 필요한 해리 솔루션의 양은 해부되는 배아 뇌의 수에 따라 달라집니다.참고: 피질 뉴런 배양을 위해 배아당 1.0mL의 파팡 용액을 준비하십시오. 최대 절전 모드 E 배지의 1mL당 20 μL의 파판 서스펜션을 약 3분 동안 소용돌이로 녹입니다. 파파인이 용해된 후 용액의 1mL당 1 μL의 DΜL을 추가합니다. DNase 후 용액을 소용돌이하지 마십시오 나는이 효소를 비활성화 할 수 있기 때문에 추가되었습니다. 심해 조직(Step 2.10)을 함유한 원심분리기 15mL 원문관(Step 2.10)에서 1, 000 x g에서 5분 동안. 상체를 제거하고 파파인 솔루션을 추가합니다. 여러 번 반전하여 조직을 다시 중단합니다. 37°C에서 30분 동안 배양하고, 10분마다 조직을 되돌려 보도록 되돌린다. 피질 뉴런을 배양하는 경우 모든 코르티체를 새로운 100mm 멸균 배양 접시에 옮기고, 조심스럽게 접시에서 미디어를 흡인하고, 미세 한 가위 또는 면도날로 조직을 다진다. 배양 접시에 파팡 용액을 추가하고 멸균 전달 파이펫을 사용하여 15mL 원상 관에 파팡 용액을 사용하여 피질 조직을 이송합니다. 조직 과 효소 용액을 37 °C에서 30 분 동안 배양하여 10 분마다 교반합니다. 30분 동안 3개의 불을 닦은 유리 파스퇴르 파이펫(1개 완전 개방, 1반개방, 1쿼터 오픈)을 준비합니다. 30분 배양 후, 10분 동안 소화된 뇌 조직을 함유한 15mL 원심형 튜브를 10분 동안 125xg에 원심분리합니다. 효소 용액을 제거하고 신선한 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨으로 대체합니다. 완전히 열린 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리하게 합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음 상체 세포 현탁액을 멸균 50 mL 원문 튜브로 옮기게하십시오. 조직에 다시 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다. 반 오픈 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리로 세리라세이트합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음, 상체 세포 현탁액을 이전 단계와 동일한 50 mL 원문 튜브로 전송하게하십시오. 조직에 다시 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다. 쿼터 오픈 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리로 세리라세이트합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음, 상체 세포 현탁액을 이전 단계와 동일한 50 mL 원식으로 다시 전달하십시오. 해리되지 않은 나머지 조직을 폐기하십시오. 원심분리기는 셀 서스펜션으로부터 상신을 포함하는 50mL 원문관을 5분 동안 125 x g에서 분리한다. 아직 완료되지 않은 경우 폴리 D-lysine 코팅 플레이트를 멸균물로 세척하고 원심 분리 중에 철저한 포부로 액체의 모든 흔적을 제거하십시오. 원심 분리 후, 상체를 폐기하고 뉴런 성장 미디어의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 트라이판 블루와 혈전계를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 피질 뉴런을 배양하는 경우, 덜 조밀 한 세포와 더 정확한 계산을 위한 신경 성장 매체의 적어도 10 mL를 추가합니다. ml 당 5 x 105 실행 가능한 세포의 최종 도금 밀도에 대한 뉴런 성장 매체와 세포를 희석하고 12 웰 플레이트의 각 우물에 희석 된 세포 현탁액 1 mL을 추가합니다. 5% CO2로37°C에서 뉴런을 유지한다.참고: 전형적으로, 1배배마우스 뇌, 즉 2해마피에서 해마는 약 1 x 106개의 실행 가능한 세포를 산출한다. 이 숫자는 실험 계획 목적으로만 제공되며 각 배양에 대한 셀 을 계산하기 위한 대체로 간주되어서는 안됩니다. 각 우물, 즉 0.5 mL에서 미디어 볼륨의 절반을 제거하고 배양 세포를 방해하지 않도록 우물 의 측면에 동일한 양의 신선한 매체를 추가하여 문화 다음 날 성장 매체를 변경합니다. 문화의 수명을 위해 매주 두 번 반 미디어 변경 완료. 4. 유동 세포측정에 의한 MHCI 발현 평가 인터페론 베타(IFNβ) 또는 뉴런 성장 미디어에서 희석제의 동등한 양을 희석하여 치료를 준비한다. 미디어 변화는 반부체 변화가 될 것이기 때문에, 2배 농축 IFNβ로 치료 매체를 준비한다. 즉, IFNβ의 100 U/mL로 12웰 플레이트의 3개의 웰을 치료하기 위해, 200 U/mL IFNβ 또는 동일한 부피의 IFNβ 희석제를 사용하여 1.5mL를 준비하여 미디어 처리 제어를 위해 희석제를 준비한다. 뉴런의 각 우물에서 0.5 mL을 제거하고 각각의 우물에 IFNβ의 유무에 관계없이 뉴런 성장 미디어의 0.5 mL을 추가합니다. 실험 조건 및 신호 최적화에 따라 정상 성장 조건(37°C, 5%CO2)에서6-72h에 대한 배양한다. 치료 시간 다음, 모든 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 보충 부족 감기 신경 물질 에서 한 번 세척 (B27, L-글루타민, 펜-스트렙). Fc 블록의 1 μg/mL을 포함하는 비 보충 된 감기 신경 물질 의 0.5 mL과 형광 공인 항 MHCI 항체의 1 μg /mL을 각각 잘 추가하십시오. 4°C에서 45분 동안 빛으로부터 보호된 인큐베이션. 항체 함유 매체를 제거하고 차가운 dPBS에서 한 번 조심스럽게 세척하십시오. 각 우물에 0.5mL 실온 효소가 없는 세포 소염 버퍼를 추가하고 세포를 제거하기 위해 동요합니다. 반전 된 조직 배양 현미경을 사용하여 해리에 대한 시계. 세포가 배양 접시에서 분리되면 각 우물에 0.5 mL의 FACS 버퍼를 추가하고, 세포를 세리로 하여 덩어리를 분산시키고, 각 웰의 총 부피를 개별 1.7 mL 마이크로 센트리슈에 튜브로 옮깁니다. 원심 분리기 1, 000 x g에서 5 분 동안. 상체를 제거하고, FACS 버퍼의 100 μL에서 셀 펠릿을 재연하고, 각 튜브의 총 부피를 96개의 U-하텀 플레이트의 개별 우물로 이송한다. 각 웰에 고정 시약 100 μL을 추가합니다. 세포가 응집하지 않도록 여러 번 삼중하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 5분 동안 500 x g의 원심분리기. 상체를 제거하고 FACS 버퍼의 200 μl에서 다시 중단합니다. 5분 동안 500 x g의 원심분리기. 미신을 제거하고 각 우물에 형광-컨쥬게이드 항-NeuN 항체(1:100 희석)를 함유한 퍼메아빌화 시약의 100μL에서 재차질한다. 잘 섞은 다음 20 분 동안 흔들면서 빛으로부터 보호 된 실온에서 배양하십시오. 인큐베이션 후 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안. 상체를 제거하고 FACS 버퍼의 100 μL에서 다시 중단합니다. 2x를 반복합니다. 최종 세척 후, FACS 버퍼에서 희석된 파라포름알데히드의 100 μL에서 세포를 재중단한다. 세포가 뭉치지 않도록 잘 섞습니다. 흐름 사이토미터에서 읽을 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호되는 4°C에 보관하십시오. 1주일 이내에 가능한 한 빨리 샘플을 읽으십시오. 5. 데이터 정량화 및 평가 각 형광염에 대한 보상 제어를 측정하고 스펙트럼 중복을 수정합니다. 이상적인 보상 컨트롤에는 얼룩이 없는 배양 된 뉴런이 포함되며, 안티 MHCI만으로 염색되며 안티 NeuN만으로 염색됩니다. 가능하면 각 샘플(최소 10,000개)에 대해 100,000개의 이벤트를 기록하고 FCS 파일로 저장합니다. 데이터를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 그림 1A-C에 설명된 대로 순차적인 게이트를 설정하여 NeuN 양성 뉴런을 선택합니다. SSC-A(로그) 대 FSC-A(선형)를 플롯합니다. 분석에서 세포 이물질을 제거하기 위해 세포 인구 (P1)에 게이트를 그립니다. P1 셀룰러 모집단 내에서 FSC-H(선형) 대 FSC-A(선형)를 플롯합니다. 단일 세포 인구에 게이트를 그립니다. 단일 셀 모집단 내에서 SSC-A(로그) 대 NeuN(로그)을 플롯합니다. 비염색형 또는 MHCI 전용 스테인드 셀을 사용하여 NeuN 양성 집단에 대한 게이트를 가이드로 그립니다. y축에서 모드로 정규화된 셀룰러 이벤트로 MHCI 형광의 히스토그램을 플롯합니다. 스테인드 또는 NeuN 전용 스테인드 뉴런을 가이드로 사용하여 수평 게이트를 그려 MHCI에 대해 양성 신경을 정량화합니다. 통계 평가 및 그래픽 도면을 위한 NeuN 양성 인구에 MHCI에 대한 MHCI에 대한 양수 세포뿐만 아니라 중간 형광 강도(MFI)를 수출한다.