按流细胞测量评估主要穆林河马神经元的主要组织相容性综合类 I 的表达

所有程序均按照《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》的建议以及《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》执行。该协议得到了北卡罗来纳大学夏洛特机构动物护理和使用委员会（协议#19-020）的批准。 1. 为文化做准备 注意：这些程序应在组织培养指定的生物安全柜中无菌条件下进行。有关媒体和解决方案，请参阅表 1。 通过在自密封灭菌袋中自动密封，对所有解剖工具进行消毒。 准备多D-lysine的工作储备，用于处理12井文化菜肴。 将聚D-lysine溶解在1x玻酸盐缓冲区中，浓度为100微克/mL（浓度为10倍）。在-20°C下存储大约1 mL的别名，直到需要为止。 将 dPBS 中的 10 倍浓缩聚 D-lysine 稀释到 10μg/mL （1x）并过滤灭菌。 在室温下以每口1x多D-lysine的0.5 mL处理12井培养板，至少1小时或过夜，供第二天使用。确保多D-lysine的体积足以完全覆盖文化区的底部。 在使用之前，从培养板中取出多D-lysine，在无菌水中冲洗3倍，并保持无菌水，直到准备好板细胞。在电镀细胞之前，通过彻底的吸气去除所有液体的痕迹。 准备神经元生长介质和 FACS 缓冲器。过滤消毒，并存储在4°C，直到使用。神经元生长介质可以保持约2周：FACS缓冲区可以保持约4周。 2. 解剖胚胎海马 注：此程序可以在台面上执行，因为它需要使用立体显微镜来去除海马的脑膜和微分。坚持严格的不化菌技术，以尽量减少潜在的污染。 在CO2 室的胚胎日18日，对一只怀孕的C57BL/6J雌性小鼠实施安乐死。 用 70% EtOH 喷洒腹部皮肤和毛皮，然后用组织钳捏皮肤，用手术剪刀做小切口。将内脏暴露在内脏和子宫内。 用标准图案钳抓住子宫，抬出腔内，用细剪刀切断与子宫的连接。将带有胚胎的子宫转移到冰上放置的100毫米无菌塑料培养盘。 使用细剪刀和细钳，小心切子宫，取出胚胎囊释放胚胎。将胚胎转移到一个新的100毫米无菌塑料培养皿中，其中含有放置在冰上的dPBS。 用细剪刀斩首胚胎幼崽，并将头转移到新的100毫米无菌塑料培养皿中，其中含有放置在冰上的冬眠-E介质。 要去除大脑，单手用一对细钳握住头部。使用弯曲的杜蒙#7钳在另一只手，插入在头骨底部的钳子尖端，捏骨头和过度的皮肤沿着中线前移动，而不会刺穿大脑。 使用弯曲的钳子拉开皮肤和头骨，露出大脑。将大脑下弯曲的钳子从暴露的嗅球扫到小脑，将大脑从头骨中抬出。将大脑转移到一个新的100毫米无菌塑料培养皿中，其中含有放置在冰上的冬眠-E介质。每个大脑重复。注：除非需要为实验特定目的分开，否则所有大脑都可以在单一培养皿中收集。 在立体解剖显微镜下，一次用一个大脑和两对无菌的杜蒙#5钳子，捏掉嗅球，拉开脑膜。彻底切除脑膜是必要的，以避免培养污染的其他细胞，并允许进一步解剖。 一旦脑膜被正确切除，皮层的上部侧向打开，这将暴露海马体。使用杜蒙#5钳，将海马从附着的皮层中捏开，并小心地将孤立的海马转移到冰上含有5mL冬眠-E介质的无菌15mL圆锥管。 重复解剖两个大脑半球为每个胚胎小鼠幼崽，并结合所有海马到一个单一的15mL锥形管，除非需要单独用于实验特定目的。 为了培养皮质神经元，皮层可能与皮层分离，处理与海马神经元相同。注意：此时，协议可能会暂停。将大脑或解剖海马储存在冬眠-E介质中，辅以 B27 （2%）在4°C长达1个月，虽然延长延迟可能会损害可行的细胞的数量。 3. 分离和培养海马神经元 注：所有程序应在组织培养指定的生物安全柜中无菌条件下进行。 为海马分离准备每个胚胎的0.5mL的木瓜分离溶液。所需的分离溶液量会因被解剖的胚胎大脑数量而异。注意：对于皮质神经元培养，为每个胚胎准备1.0 mL的木瓜蛋白溶液。 通过旋转约3分钟，每1 mL的冬眠E介质溶解20μL的木瓜因悬浮。 帕潘溶解后，每1mL溶液中加入1μL的DNase I。在添加 DNase I 后不要旋转溶液，因为这样可以停用酶。 离心机 15 mL 圆锥管包含海马组织 （步骤 2.10） 在 1，000 x g 5 分钟。删除超自然，并添加帕金解决方案。通过倒置几次来补充组织。在 37 °C 下孵育 30 分钟，每 10 分钟倒置一次组织。 如果培养皮质神经元，将所有皮质转移到新的100毫米无菌培养皿中，小心地从盘子中吸气介质，用细剪刀或剃须刀刀片将肉末组织切碎。将木瓜素溶液加入培养皿中，并用木瓜溶液将皮质组织使用无菌转移移液器转移到 15 mL 锥形管中。在 37 °C 下孵化组织和酶溶液 30 分钟，每 10 分钟搅拌一次。 在30分钟的孵化过程中，准备3个火抛光玻璃巴斯德移液器：1个完全打开，1个半开，1个季度打开。 30分钟孵化后，离心机15mL圆锥管，内含消化脑组织，125 x g，10分钟。 取出酶溶液，代之以同等数量的新鲜冬眠 E 介质。 使用完全打开的巴斯德移液器，将组织三次修剪10倍。让组织沉淀2分钟，然后将超自然细胞悬架转移到无菌的50mL圆锥管。将等量的冬眠 E 介质添加到组织中。 使用半开巴氏杆菌移液器，三叶草组织10倍。让组织稳定2分钟，然后将超自然细胞悬架转移到与前一步相同的50mL圆锥管。将等量的冬眠 E 介质添加到组织中。 使用四分之一打开巴斯德移液器，三叶草组织10倍。让组织稳定2分钟，然后再次将超自然细胞悬架转移到与之前步骤相同的50mL圆锥体。丢弃任何未分离的剩余组织。 将含有超母体的50mL圆锥管从细胞悬架中分离出，在125 x g 下5分钟。如果尚未完成，则用无菌水清洗多 D-lysine 涂层板，并在离心过程中通过彻底吸入去除所有液体痕迹。 离心后，丢弃超自然物，在神经元生长介质的5mL中补充细胞颗粒。使用尝试盘蓝色和血细胞仪数活细胞。 如果培养皮质神经元，添加至少10mL的神经元生长介质，以减少细胞密度和更准确的计数。 稀释具有神经元生长介质的细胞，最终电镀密度为每毫升 5 x10 5 个可行的细胞，并在 12 个井板的每口井中加入 1 毫升稀释细胞悬浮。将神经元保持在37°C，二氧化碳2为5%。注：通常，海马从1个胚胎小鼠的大脑，即2海马，产生约1×106 个可行的细胞。这个数字仅用于实验规划目的，不应被视为每个培养细胞计数的替代品。 在培养后的第二天改变生长介质，从每口井中去除一半的介质，即 0.5 mL，并在井边添加同等数量的新鲜介质，以避免破坏培养细胞。完成半媒体更改每周两次的文化寿命。 4. 通过流动细胞测量评估MHCI表达 通过稀释干扰素β（IFN+）或神经元生长介质中等量的稀释剂来准备治疗。由于媒体更改将是半卷更改，使用 2 倍集中的 IFN® 准备治疗介质。即，用 100 U/mL IFN® 处理 12 口井板中的 3 口井，用 200 U/mL IFN® 或等量的 IFN® 稀释剂准备 1.5 mL，用于介质处理控制。 从每口神经元井中取出 0.5 mL，并在每口井中加入 0.5 mL 的神经元生长介质（无论有没有 IFN®）。根据实验条件和信号优化，在正常生长条件下（37 °C，5% CO2）孵化6-72小时。 治疗后，取出所有培养介质，在缺乏补充剂的冷神经巴介质（B27，L-谷氨酰胺，笔链）中轻轻洗一次。 向每口井添加 0.5 mL 的非补充冷神经巴塞介质，其中含有 1μg/mL 的 Fc 块和 1 μg/mL 的荧光共聚抗 MHCI 抗体。在4°C下孵化，防止光线照射45分钟。 取出含有抗体的介质，在冷 dPBS 中小心清洗一次。将 0.5 mL 无室温无酶细胞分离缓冲器添加到每个井中，并搅拌以驱离细胞。使用倒置组织培养显微镜观察分离。 细胞从培养皿中分离后，向每口井添加 0.5 mL 的 FACS 缓冲器，将细胞三流化以分散团块，并将每口井的总体积转移到单独的 1.7 mL 微中微富格管中。 离心机在 1，000 x g 5 分钟。取出超自然物，将细胞颗粒重新用100μL的FACS缓冲器，并将每个管子的总体积转移到96口井U底板的单独井中。 在每口井中加入 100μL 的固定试剂。在室温下，在室温下进行多次三扰，以避免细胞聚集和孵育15分钟，不受光线照射。 离心机在500 x g 5分钟。取出超自然物，并在 200 μl 的 FACS 缓冲区中重新发送。 离心机在500 x g 5分钟。将含有荧光共聚抗NeuN抗体（1：100稀释）的渗透试剂中的超纳特去除并重新喷出。混合好，然后在室温下孵化，防止光线与摇动20分钟。 孵化后，离心机在500 x g 下5分钟。在 100 μL 的 FACS 缓冲区中去除超自然并重新喷出。重复2次。 最后洗涤后，在 FACS 缓冲区稀释的 100 μL 中稀释 2% 副甲醛的细胞。混合好以防止细胞团块。存储在4°C保护免受光，直到准备阅读流细胞仪。尽快阅读样品，在1周内。 5. 量化和评估数据 测量每个荧光染料的补偿控制，并纠正任何光谱重叠。理想的补偿控制包括未染色的培养神经元，仅带有抗MHCI的污渍，仅带有抗NeuN。 如果可能，为每个示例记录 100，000 个事件（至少 10，000 个事件），并保存为 FCS 文件。 要分析数据，使用适当的分析软件，设置顺序门，如 图1A-C 所示，以选择NeuN阳性神经元。 绘图SSC-A（日志）与FSC-A（线性）。在细胞群 （P1） 上绘制一个门，以消除分析中的细胞碎片。 在 P1 蜂窝群中，绘图 FSC-H（线性）与 FSC-A（线性）。绘制单细胞群的门。 在单个单元格群中，绘图 SSC-A（日志）与 NeuN（日志）。使用未染色或仅限 MHCI 的染色细胞绘制 NeuN 阳性人群的大门作为指南。 绘制 MHCI 荧光的直方图，将细胞事件标准化为 y 轴上的模式。使用未染色或仅采用 NeuN 的彩色神经元作为指南，绘制水平门，以量化 MHCI 阳性的百分比神经元。 出口 MHCI 的百分比细胞正数，以及 MHCI 在 NeuN 阳性人群中的荧光强度中位数 （MFI），用于统计评估和图形绘图。