非肝细胞293T-NE-3NRS细胞中乙型肝炎病毒感染的建模
Summary
本手稿描述了新型工程293T细胞（293T-NE-3NRS，表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+）和传统肝细胞（HepG2-NE，表达人类NTCP）中乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细方案。
Abstract
HBV主要感染人类肝细胞，但也被发现感染肾外组织，如肾脏和睾丸。尽管如此，基于细胞的HBV模型仅限于肝瘤细胞系（如 HepG2 和 Huh7）过度表达功能性HBV受体，钠陶罗胆酸盐共同运输多肽（NTCP）。在这里，我们使用293T-NE-3NR（293T过度表达人类NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+）和 HepG2-NE（HepG2 过行NTCP）作为模型细胞系。 这些细胞系中的HBV感染是通过使用来自 HepG2.2.15 的浓缩 HBV 病毒颗粒或与目标细胞系共同培养 HepG2.2.15 进行的。为HBcAg执行HBcAg免疫荧光以确认HBV感染。这里介绍的两种方法将有助于我们研究非肝细胞系的HBV感染。
Introduction
乙型肝炎影响20多亿人的生命，是公共卫生面临的主要威胁之一。全世界约有2.57亿人长期感染乙型肝炎病毒（HBV），给社会带来沉重负担。肝细胞不是受HBV感染的唯一细胞，非肝组织中的其他细胞，如肾脏和睾丸，也感染了这种病毒2,2，3。目前，HBV感染细胞模型仅限于人类肝细胞，只有很少的非肝细胞系模型。这妨碍了对乙肝病毒感染和非肝组织乙肝病毒相关病理学的研究。在这里，我们提出了在非肝293T细胞以及基于肝瘤的细胞中研究HBV感染的协议。
陶罗胆酸钠与多肽（NTCP）是人体乙型肝炎和D型肝炎病毒4的功能受体。肝细胞核因子4°（HNF4°）、视网膜X受体+（RXR+）和过氧化物增殖剂活化受体（PPAR+）是限制HBV病毒性转录因子的肝状转录因子。它们已被验证，以促进HBV基因组RNA合成，并支持HBV复制在非肝瘤细胞系5。我们构建了三种不同的细胞系，表示NTCP（HepG2-NE）的 HepG2细胞系，表达NTCP（293T-NE）的293T细胞系和表达四个宿主基因的293T细胞系;NTCP、HNF4+、RXR+和PAR+（293T-NE-3NR）。基于293T-NE-3NRs开发了两种乙肝病毒感染方法（图1）。第一种方法使用接种293T-NE-3NR高病毒基因组等效性（高GEq（150），DMSO和PEG8000）24小时。第二种方法采用与 HepG2.2.15 共同培养 293T-NE-3NR 的方法，它可以产生 HBV 粒子（低 GEq（约 1.83），无需 DMSO 和 PEG8000），从而密切模拟自然条件。
HepG2.2.15细胞来自 HepG2 线和慢性分泌传染性 HBV，以及亚病毒颗粒进入培养基 6，7,7。Cyclosporin A （CsA） 是一种免疫抑制剂，临床上用于抑制异种移植排斥。研究表明，CSA通过抑制NTCP的运输机活性，阻断NTCP与大包络蛋白8的结合，抑制HBV进入培养的肝细胞。
HepG2-NE细胞用作阳性对照，而CsA处理细胞用作阴性对照。通过与阳性和阴性对照组进行比较，我们可以找出哪些宿主基因在HBV感染中起着关键作用。此外，通过这种乙肝病毒感染模式，我们还可以找到其他与乙肝病毒感染相关的新机制或宿主基因。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们介绍非肝293T-NE-3NR和基于肝瘤的HpG2-NE细胞的HBV感染方案。293T-NE-3NR 适用于高低 GEq 的 HBV 感染。在使用我们的协议时，需要考虑以下关键步骤。细胞状态是成功感染的重要因素。在HBV感染的初始阶段后，必须及时改变感染媒介。293T-NE-3NRs细胞在感染高病毒滴答声后通常很脆弱。因此，这些细胞必须轻轻清洗，以避免在感染24小时后分离细胞。在使用膜插入物进行培养时，我们必须确保?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（第81870432号和81570567至X.L.Z.）、国际青年科学家研究基金（第81571994号至P.N.S.）的支持（第81950410640号至W.I.）;李嘉诚汕头大学基金会（第1号）L1111 2008 至 P.N.S.）。我们感谢汕头大学医学院的林士丹教授提供有用的建议。
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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