비 간염 293T-NE-3NRs 세포에 있는 B형 간염 바이러스 감염을 모델링
Summary
이 원고는 인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα를 발현하는 새로운 엔지니어링 293T-NE-3NR및 전통적인 간 세포(HepG2-NE, 인간 NTCP를 표현하는 HepG2-NE)에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
HBV는 주로 인간 간세포를 감염하지만 신장과 고환과 같은 외형 조직을 감염하는 것으로 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고, 세포계 HBV 모델은 기능성 HBV 수용체, 타우로콜라산 나트륨 공동 수송 폴리펩티드(NTCP)를 과발현하는 헤파종 세포주(HepG2 및 Huh7와 같은)로 제한됩니다. 여기서, 우리는 293T-NE-3NR (인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα)와 HepG2-NE (HepG2 과발현 NTCP)를 모델 세포주로 사용했습니다. 이들 세포주에서 HBV 감염은 HepG2.2.15로부터 농축 HBV 바이러스 입자를 사용하거나 표적 세포주를 이용한 HepG2.2.15를 공동 배양함으로써 수행되었다. HBcAg에 대한 HBcAg 면역 형광은 HBV 감염을 확인하기 위해 수행되었다. 여기에 제시된 2개의 방법은 우리가 비 간 세포주에서 HBV 감염을 공부하는 것을 도울 것입니다.
Introduction
B형 간염은 20억 명 이상의 사람들의 삶에 영향을 미치며 공중 보건에 대한 주요 위협 중 하나입니다. 약 2억 5,700만 명이 전 세계적으로 B형 간염 바이러스(HBV)에 만성적으로 감염되어 사회1에큰 부담을 주고 있다. 간세포는 신장 및 고환과 같은 비간 조직에서 HBV 및 기타 세포에 감염된 유일한 세포가 아니며, 또한 이 바이러스2,,3에의해 감염된다. 현재, HBV 감염 세포 모델은 단지 몇몇 비간 세포주 모형을 가진 인간 간세포로 제한됩니다. 이것은 비 간 조직의 HBV 감염 그리고 HBV 관련 병리학의 연구 결과 방해합니다. 여기서 우리는 비간 293T 세포뿐만 아니라 간종 기반 세포에서 HBV 감염을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
타우로콜라산 나트륨 공동 수송 폴리펩티드(NTCP)는 인간 B형 간염 및 D형 간염 바이러스4를위한 기능성 수용체이다. 간세포 핵인자 4α(HNF4α), 레티노이드 X 수용체 α(RXRα) 및 과옥시성 증식체 활성화 수용체 α(PPARα)는 HBV의 바이러스 성 트로피주의를 제한하는 간 농축 전사 인자이다. 그들은 HBV 유전체 RNA 합성을 촉진하고 비 hepatoma 세포주5에서HBV 복제를 지원하기 위해 검증되었습니다. 우리는 NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) 및 4개의 숙주 유전자를 표현하는 293T 세포주를 표현하는 3개의 상이한 세포주를 건설했습니다; NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα (293T-NE-3NRs). HBV 감염을 위한 2개의 방법은 293T-NE-3NR(도 1)에기초하여 개발되었다. 첫 번째 방법은 24h에 대해 높은 바이러스 게놈 동등성 (높은 GEq (150), DMSO 및 PEG8000)를 가진 293T-NE-3NRs에서 접종을 사용합니다. 두 번째 방법은 HepG2.2.15와 함께 293T-NE-3NR을 공동 배양하여 DMSO 및 PEG8000 없이 HBV 입자(약 1.83)를 생성할 수 있으므로 자연 조건을 밀접하게 모방합니다.
HepG2.2.15 세포는 HepG2 선으로부터 유래되고 만성 적으로 전염성 HBV를 분비하고, 서브바이러스 입자를 배양배지6,7로유도한다. 사이클로스포린 A(CsA)는 제노이식 거부억제에 임상적으로 사용되는 면역억제제이다. 연구 결과에 따르면 CsA는 NTCP의 수송 활성을 억제하고 NTCP의 결합을 큰 봉투 단백질8에차단함으로써 배양 된 간세포로HBV 입력을 억제하는 것으로 나타났습니다.
HepG2-NE 세포는 CsA 처리 된 세포가 음의 대조군으로 사용되는 반면 양성 제어로 사용되었습니다. 긍정적이고 부정적인 대조군과 비교해서, 우리는 HBV 감염에 있는 중요한 역할을 하는 호스트 유전자를 알아낼 수 있습니다. 추가적으로, HBV 감염의 이 모드를 통해, 우리는 또한 HBV 감염에 관련시킨 그밖 새로운 기계장치 또는 호스트 유전자를 찾아볼 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 비간 293T-NE-3NR 및 hepatoma 기지를 둔 HepG2-NE 세포에 있는 HBV 감염을 위한 프로토콜을 소개합니다. 293T-NE-3NR은 높고 낮은 GEq 모두에서 HBV 감염에 적합했다. 프로토콜을 사용하는 동안 다음과 같은 중요한 단계를 고려해야 합니다. 세포 상태는 성공적인 감염을 위한 중요한 요인입니다. 감염 배지는 HBV 감염의 초기 기간 후에 적시에 변경되어야 합니다. 293T-NE-3NRs 세포는 일반적으로 높은…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81870432호와 X.L.Z.)에 의해 지원되었으며, (81571994에서 P.N.S.까지), 국제 영과학자 연구 기금(81950410640위)이 지원했습니다. 리카싱 산투 대학 재단 (아니. L1111 2008 – P.N.S.). 샨투 대학 의과 대학의 스탠리 린 교수에게 유용한 조언을 구해 주셔서 감사합니다.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
Riferimenti
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