Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

O advento das preparações de fatias cerebrais agudas de mamíferos facilitou experimentos no nível celular e sináptico que antes eram possíveis apenas em preparações de invertebrados como a Aplysia¹. O desenvolvimento de fatias hipocampais agudas foi de particular significado, pois é uma estrutura responsável pela formação da memória e do contexto, e possui um circuito tri-sináptico especializado que é amenable à fácil manipulação fisiológica. No entanto, a grande maioria das fatias cerebrais agudas ainda são preparadas a partir de camundongos e ratos relativamente jovens, pois é mais fácil preservar neurônios e circuitos saudáveis, e as fatias permanecem viáveis por períodos mais longos de tempo^2,3,4. Aqui, introduzimos modificações nos protocolos de corte padrão que resultam em maior viabilidade de fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos.

O principal impedimento para a viabilidade ex vivo a longo prazo do parenchyma cerebral mamífero é o dano hipóxico inicial que ocorre rapidamente quando o fluxo sanguíneo para o cérebro pára após a decapitação. A perda de oxigênio resulta no rápido consumo metabólico dos principais recursos energéticos do cérebro, sendo a perda de fosfo-creatina (P-creatina) a mais rápida, seguida por glicose, adenosina triptofato (ATP) e glicógeno⁴. A preservação da ATP é de particular importância para a saúde a longo prazo das fatias cerebrais, pois a ATP é necessária para manter o potencial de membrana através do ATPase Na-K e, consequentemente, da atividade neural^5,,6. O nível ATP no cérebro de roedor adulto é de ~2,5 mM, e cai vertiginosamente dentro de 20 s de decapitação para alcançar um estado basal estável (~0,5 mM) em torno de 1 min pós-decapitação^4,,7,,8. Em animais jovens, leva mais tempo para observar a mesma queda em ATP (~2 min); com anestesia fenobarbital é ainda mais retardada para 4 min⁴. Essas considerações mostram que prevenir a perda de ATP e outros recursos energéticos é uma estratégia necessária para evitar danos hipóxicos ao cérebro e, por sua vez, manter a saúde das fatias cerebrais por períodos mais longos de tempo, especialmente em animais adultos.

Baixas temperaturas atrasam o metabolismo. Consequentemente, foi demonstrado que a hipotermia modesta protege as reservas de energia cerebral: em animais jovens, reduzindo a temperatura corporal em seis graus, de 37 °C para 31 °C, preserva os níveis de ATP para cerca de 80% dos níveis normais acima de 4h de hipóxia controlada⁹. Os níveis de p-creatina são igualmente preservados, bem como o potencial global de fosforilação⁹. Isso sugere que a redução da temperatura corporal antes da decapitação pode ser neuroprotetora, uma vez que os níveis quase normais de ATP poderiam ser mantidos através dos períodos de corte de fatias e recuperação de fatias.

Na medida em que uma queda de ATP não pode ser completamente impedida após a decapitação, espera-se uma função parcialmente prejudicada do ATPase Na-K, seguida de despolarização via influxo passivo de sódio. Como o fluxo passivo de sódio é seguido pela entrada de água nas células, causa edema citotóxico e, eventualmente, pyknose. Em ratos adultos, substituir íons Na+ por sacarose em soluções de corte de fatias tem sido uma estratégia bem sucedida para aliviar a carga do edema citotóxico^10,11. Mais recentemente, as cáras orgânicas metiladas que diminuem a permeabilidade do canal de sódio¹² têm mostrado oferecer proteção mais eficaz do que a sacarose, especialmente em fatias de camundongos adultos, com n-metil-D-glucamine (NMDG) sendo mais amplamente aplicável em diferentes idades e regiões cerebrais^{13,,14,,15,,16}.

Numerosos protocolos de corte cerebral envolvem o uso de temperaturas frias apenas durante a etapa de corte de fatias, às vezes em combinação com a estratégia de substituição de íons Na^{+ 16,17}. Em animais jovens, esses protocolos parecem oferecer neuroproteção suficiente, uma vez que os cérebros podem ser extraídos rapidamente após a decapitação porque o crânio ainda é fino e fácil de remover³. No entanto, essa estratégia não produz fatias saudáveis de animais adultos. Com o tempo, vários laboratórios que estudam roedores adultos introduziram perfusão transcárrica com uma solução gelada para diminuir a temperatura corporal do animal e, portanto, danos hipóxicos ao cérebro, antes da decapitação. Este procedimento foi aplicado com sucesso para produzir fatias cerebelares¹⁸, fatias de cérebro médio¹⁹, fatias neocorticais^11,20, córtex perirhinal²¹, hipocampo de rato^10,22,23, bulbo olfativo²⁴, estriado ventral²⁵, córtex visual²⁶.

Apesar das vantagens oferecidas pela perfusão transcárdia e substituição^de íons na preparação de fatias de ratos e em algumas regiões cerebrais em camundongos, o hipocampo de camundongos continua sendo uma das áreas mais desafiadoras para proteger da hipóxia^13,20. Até o momento, uma das abordagens mais comuns para cortar hipocampo de camundongos envelhecidos e modelos de camundongos de neurodegeneração envolve o corte rápido clássico do hipocampo isolado²⁷. No protocolo aqui descrito, minimizamos a perda de ATP no cérebro adulto introduzindo hipotermia antes da decapitação, perfumando transcardialmente o animal com Na⁺– fluido cerebrospinal artificial à base de NMDG (NMDG-aCSF). As fatias são então cortadas em Na⁺-free NMDG-aCSF. Com este protocolo aprimorado, obtemos fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos que são saudáveis por até 10 h após o corte e são apropriados para gravações de campo de longo prazo e estudos de grampo de remendo.