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Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

Published: September 18, 2020
doi:
10.3791/61368
, , ,
1Department of Molecular Biology and Biochemistry,Rutgers University

Summary

Este protocolo descreve abordagens para detecção e quantitação de grandes extrusões agregadas e/ou organelas (~4 μm) produzidas por células C. elegans na forma de exóferas ligadas à membrana. Descrevemos tensões, condições de crescimento, critérios de pontuação, considerações de tempo e microscopia necessárias para facilitar a dissecção desse mecanismo de expulsão de detritos.

Abstract

A toxicidade de proteínas mal dobradas e disfunção mitocondrial são fatores fundamentais que promovem o declínio neuronal funcional associado à idade e a doença neurodegenerativa entre as espécies. Embora esses desafios neurotóxicos tenham sido considerados por muito tempo intrínsecos, evidências consideráveis agora sustentam que proteínas de doenças humanas desdobradas originárias de um neurônio podem aparecer em células vizinhas, um fenômeno proposto para promover a disseminação da patologia em doenças neurodegenerativas humanas.

C. elegans neurônios adultos que expressam proteínas agregantes podem extruir grandes vesículas cercadas por membrana (~4 μm) que podem incluir a proteína agregada, mitocôndrias e lisósmosomos. Essas grandes vesículas são chamadas de “exóferas” e são distintas de exosóis (que são cerca de 100x menores e têm biogênese diferente). A expulsão de detritos celulares em exófações pode ocorrer por um mecanismo conservado que constitui um ramo fundamental, mas anteriormente não reconhecido, de proteostase neuronal e controle de qualidade mitocondrial, relevante para processos pelos quais agregados se espalham em doenças neurodegenerativas humanas.

Embora os exóphers tenham sido estudados principalmente em animais que expressam mCherry transgênicos de alta cópia dentro dos neurônios de toque, esses protocolos são igualmente úteis no estudo da exofergênese usando organelas fluorescentes marcadas ou outras proteínas de interesse em várias classes de neurônios.

Descritas aqui estão as características físicas dos exophers de C. elegans, estratégias para sua detecção, critérios de identificação, tempo ideal para a quantitação e protocolos de crescimento animal que controlam para tensões que podem modular os níveis de produção exopher. Juntos, os detalhes dos protocolos aqui descritos devem servir para estabelecer um padrão de análise quantitativa de exóferos entre laboratórios. Este documento busca servir como um recurso no campo para laboratórios que buscam elaborar mecanismos moleculares pelos quais as exófias são produzidas e pelas quais as exófilos são reagidas por células vizinhas e distantes.

Introduction

Os desafios neurotóxicos de agregados e mitocôndrias disfuncionais têm sido considerados intrínsecos por células, mas mais recentemente ficou claro que proteínas da doença humana desativadas originárias de um neurônio também podem se espalhar para células vizinhas, promovendo a patologia1. Da mesma forma, mitocôndrias mamíferas podem ser enviadas da célula de sua produção original para degradação transcelular2 ou para resgate de populações mitocondriais em células vizinhas desafiadas3. Vesículas de vários tamanhos têm sido geralmente observadas para transferir materiais celulares para células vizinhas ou para o ambiente fluido4. Algumas vesículas extrudadas se aproximam do tamanho da soma neuronal média (média do neurônio de toque soma ~ 6 μm) e podem acomodar grandes agregados e organelas.

Um exemplo marcante de grande extrusão vesícula que pode transportar agregados de proteínas e organelas ocorre em C. elegans touch receptor neurônios que expressam um alto número de cópia repórter construir codificação de um mCherry5propenso à agregação nociva, resistente à degradação . Extrusões dos neurônios sensíveis ao toque, chamados exophers, têm ~4 μm de diâmetro médio, incluem seletivamente mCherry ou outros agregados, e são entregues diretamente na hipodermis vizinha, que normalmente envolve os neurônios receptores de toque. A hipoderme tenta degradação à base de lysosome, mas alguns conteúdos não digestíveis, como agregados mCherry, podem ser reinteressados pela hipoderme no pseudocoeloma cheio de fluidos do animal, a partir do qual o mCherry pode ser tomado por células remotas de catadores chamadas coelomocitos para armazenamento a longo prazo(Figura 1, Figura 2)5.

As grandes vesículas extrudadas extrudadas deixam a célula cercada pela membrana plasmática do receptor de toque e podem conter proteínas agregadas da doença humana, mitocôndrias e lisosomos. O processo de produção de exopher parece envolver a classificação de espécies potencialmente tóxicas (por exemplo, um mCherry expresso propenso à agregação é segregado de proteínas solúveis e inofensivas como o GFP que permanece principalmente na soma neuronal). Dessa forma, a expulsão direcionada das entidades ameaçadoras é realizada pelo neurônio5. Um desafio de proteostase, como o estresse induzido pelo knockdown da autofagia, inibição proteasome mediada por MG132, ou expressão transgênica de proteínas de doenças humanas, como a poliglutamina expandida Q128 associada à doença de Huntington ou o fragmento implicado pela doença de Alzheimer Aβ1-42,pode aumentar o número de neurônios que produzem exófatos5.

Como os exófilos foram documentados recentemente, o que se sabe de sua descrição de méritos biológicos. Exóferos foram descobertos em, e são os mais bem estudados em, C. elegans touch receptor neurônios. Existem seis neurônios de toque mecanosensoriar C. elegans que têm corpos celulares distribuídos ao redor do corpo (Figura 3A) e são chamados de células microtúbulas porque sua ultraestrutura apresenta 15 microtúbulos de perfil. Os neurônios do receptor de toque são o AVM anterior (neurônio microtúbulo ventral anterior), ALMR e ALML (neurônios microtúbulos laterais anteriores direita e esquerda), o PVM mais central (neurônio microtúbulo ventral posterior) e o PLMR e PLML posteriores (neurônios microtúbulos laterais posteriores direito e esquerdo) na cauda. Curiosamente, os neurônios receptores de seis toques produzem exófações em taxas diferentes, apesar de expressarem o mesmo transgene ofensivo(Figura 3C). Dos seis neurônios receptores de toque mecanosensorial, o neurônio ALMR sofre exofergênese com mais frequência do que os outros neurônios sensíveis ao toque. A quantitação dos números exóferos dos neurônios sensíveis ao toque é, portanto, geralmente estabelecida por foco na ALMR.

Exofergênese é um processo dinâmico que normalmente começa com o inchaço do citoplasma neuronal (Figura 1A-B). O conteúdo celular, organelas ou agregados proteicos são coletados para um lado da soma neuronal, mais comumente na extremidade posterior do neurônio ALMR (longe do neurite projetando), formando um domínio pré-exopher (PED) (Figura 1B). A saliência inicial é observada à medida que o PED começa a projetar para fora, formando um broto saliente reconhecível. O broto tardio é definido quando o diâmetro mais largo do domínio pré-exopher é aproximadamente 1/3 maior do que o diâmetro da constrição do pescoço soma-exopher(Figura 1C). Exóferos podem ser ejetados em quase qualquer direção da soma, mas a maioria dos exóferos sai posteriormente do corpo celular e permanece aproximadamente no mesmo plano focal que a soma originária.

O exopher pode se afastar da soma originária à medida que o pescoço do broto se estreita em um filamento fino. Exóferos podem permanecer ligados à soma através deste filamento (Figura 1D, seta) e podem mais tarde se desvincular. Conteúdos celulares como cálcio, agregados e mitocôndrias podem ser transferidos através deste filamento para a esferoferaanexada 5, embora a maior parte do material extrudado seja colocada no compartimento exófero pelo evento de brotação maciça. Os exóferos são considerados maduros quando não há tubo de conexão visível ou filamento fino e a esfófera é totalmente separada da soma de envio(Figura 1E).

Exofers produzidos por C. elegans tocam neurônios imediatamente encontram a hipoderme, o tecido que envolve o neurônio de toque. Mais comumente, a vesícula exófação parece viajar dentro da hipodermes posteriormente em direção à cauda, e pode ser bastante distante da soma antes que o conteúdo exopher apareça alvo de degradação (por exemplo, a distância pode ser ~100 μm de distância da soma (Figura 1F).). A vesícula exófé fluorescente se divide em muitas vesículas menores dentro da hipodermes, assumindo uma aparência chamada “noite estrelada”(Figura 1G e Figura 2). No estágio da “noite estrelada”, material fluorescente pontual pode ser observado espalhado pelo siníntécio hipodérmico em muitos pontos menores de fluorescência em comparação com o exoferimento solitário original. A noite estrelada pode parecer pontual sob baixa ampliação e com maior ampliação, pode parecer pontual e/ou em rede dentro da hipodermite. O sinal fluorescente da noite estrelada é tipicamente mais fraco que o exopher e a fluorescência expressa neuronalmente(Figura 2B-C). Acredita-se que a dispersão do mCherry em muitas vesículas pontuadas envolva a maturação e fusão com a rede endossomal/liososômica da célula hipodérmica. Alguns materiais exópher são provavelmente degradados na rede hipodermal lysosomal, mas espécies residuais resistentes à degradação (como agregados mCherry) são jogadas para fora da hipodermese no pseudocoelom, um compartimento fluido que pode conter detritos celulares. O material fluorescente é posteriormente acolhida por células remotas de carniceiros chamadas coelomócitos(Figura 2C),que podem concentrar, armazenar e tentar novamente a degradação do mCherry.

O fenômeno da extrusão e transferência agregada aparece conservado em filos, tendo sido relatado em modelos genéticos como C. elegans5,,6,7 e D. melanogaster8,9, bem como em múltiplos modelos de mamíferos. Extrusões semelhantes a exófias foram relatadas para células de mamíferos10, uma observação sugerindo que mecanismos conservados podem estar por trás da expulsão agregada e organela. A produção de exófação pode, portanto, ser um mecanismo conservado do manejo de detritos celulares que constitui um ramo fundamental, mas anteriormente não reconhecido, de proteostase neuronal e controle de qualidade mitocondrial, que, quando desequilibrado, pode contribuir ativamente para a doença neurodegenerativa. Identificação das moléculas envolvidas na discriminação e triagem de detritos, transporte para um local subcelular distinto, extrusão, formação/cissão da conexão tubular que liga a soma e exoferimento tardio, e o reconhecimento da grande vesícula extrudada para degradação remota por uma célula vizinha permanecem para trabalhos futuros. Estudos em modelos de nematoide e mosca serão criticamente importantes para definir mecanismos de coleta e transferência de organelas agregadas e organelas, utilizando abordagens genéticas imparcial e poderosas ferramentas biológicas celulares oferecidas por esses modelos para identificar moléculas participantes no contexto fisiológico.

Os primeiros passos críticos na decifração de mecanismos operacionais na biologia exófia envolvem a definição de protocolos para quantificação in vivo exopher reproduzível. O modelo C. elegans oferece uma vantagem particular para tais esforços, uma vez que o corpo é transparente e exóferos podem ser facilmente observados quando contêm proteínas fluorescentes marcadas ou organelas. Os exófatos foram relatados como gerados por C. elegans neurônios dopaminérgicos PDE e CEP, neurônios sensoriais ASE e ASER, e neurônios anfíides de preenchimento de corantes5. Como as exófações produzidas pelos neurônios receptores de toque são melhor caracterizadas, o foco aqui é o uso de neurônios sensíveis ao toque para análise exófia. No entanto, a abordagem básica pode ser aplicada para medir a produção de exóferos de qualquer célula. Protocolos para detectar e quantificar exófatos produzidos por C. elegans touch receptor neurônios que expressam transgenicamente proteína mCherry são delineados, com ênfase em cargas que podem ser monitoradas e restrições temporais na pontuação. Este artigo define abordagens para a identificação in vivo exopher, e a quantitação de condições ambientais e genéticas que modulam a produção de exóferos. Os protocolos enfatizam a atenção crítica às constantes condições de não estresse para a determinação da produção de exófias de linha de base e para comparações entre genótipos.

Protocol

1. Cepas úteis para detecção de exóferos Selecione uma cepa que expresse cargas fluorescentes dentro dos neurônios de C. elegans para visualizar prontamente exofers.NOTA: A Tabela 1 lista cepas que foram usadas para visualizar exófatos produzidos nos neurônios receptores de toque5,,11,12. Em princípio, qualquer tipo de célula ou neuronal pode ser testado para produção de exopher usando um promotor específico de células ou tecidos para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente que agrega ou é selecionada para extrusão. Alternativamente, use um ensaio de enchimento de corantes para visualizar exófações nos neurônios da cabeça anfídida, que estão abertos ao ambiente e capazes de encher5,,13. 2. Mídia de crescimento Prepare a mídia padrão de crescimento do nematoide (NGM) para as cepas de cultura de acordo com os métodos padrão14,15.NOTA: A falta de alimentos, ou fluoro-desoxyuridina (FuDR), usada comumente para bloquear a produção de prole, pode afetar drasticamente a produção de exóferos. Mantenha a população continuamente alimentada (evite mesmo períodos curtos de exaustão alimentar bacteriana) e mantenha os animais em temperatura constante. 3. Pecuária crítica para produção consistente de exopher Crie animais em mídia consistente e com fontes de alimento bacteriana consistentes. Os animais não devem ficar sem alimentos bacterianos, mesmo por curtos períodos de tempo, uma vez que a limitação alimentar pode alterar drasticamente os níveis de produção exopher. Mantenha receitas de mídia e uniforme de preparação durante um estudo.NOTA: A alteração da mídia pode afetar os níveis basais de produção de exofer. Os lotes de ágar podem influenciar os níveis de exópher da linha de base, por isso, quando os lotes de fornecimento mudam, anote a data. Jogue fora as placas de estoque após duas semanas para garantir alimentos bacterianos saudáveis e para prevenir o ágar seco, o que causa alterações na osmolaridade do ágar que influenciam os níveis de exóferos. Para condições basais, mantenha os animais a uma temperatura constante de 20 °C. Criar animais a temperaturas variáveis (mesmo mudanças temporárias na temperatura) pode causar variações no tempo de produção de exofers máximos.NOTA: A variabilidade da temperatura não se limita às condições da cultura. As variações de temperaturas durante experimentos ou no banco do laboratório podem ser impactantes. Por exemplo, as temperaturas dentro de uma sala de microscópio não devem diferir dramaticamente da incubadora de cultura ou banco de laboratório. Não utilize intervenções anti-fertilidade farmacológicas porque os ovos fertilizados são fundamentais para a produção precoce de exófilos adultos.NOTA: Deve-se evitar o uso de Fluoro-desoxyuridina (FuDR)16 ou C2217. Ao realizar experimentos em tempo de vida ou animais antigos, as populações sincronizadas pela idade devem ser mantidas removendo fisicamente os adultos de sua prole menor, escolhendo-os em placas frescas espalhadas por bactérias em vez de usar intervenções anti-fertilidade farmacológicas comuns. Não use culturas contaminadas; reiniciar experimentos em caso de comprometimento biológico da população ou da placa. A contaminação bacteriana ou fúngica pode induzir estresses e alterações metabólicas em animais e deve estar ausente de populações experimentais. Para maximizar os resultados reprodutíveis, mantenha culturas para pelo menos duas gerações saudáveis, bem alimentadas e livres de contaminação a 20 °C antes da experimentação para evitar potenciais alterações epigenéticas induzidas pelo ambiente. 4. Sincronização etária para pontuação de exópher por branqueamento, flutuação de sacarose ou colheita de larvas L4 Manter as populações experimentais na mesma idade biológica, pois os padrões de detecção de exóferos variam com a idade adulta e a comparação de animais de populações em idade mista pode confundir resultados. Sempre garanta a sincronização bem sucedida das populações animais experimentais, verificando a morfologia da vulva “crescente branca” na fase L4.NOTA: Geralmente, a produção de pico de exófia para os neurônios MEchanosensorio ALMR ocorre no dia adulto 2-3 (Figura 3D), medida a partir de dias após a fase L4. O dia 1 adulto é 24 horas após o estágio larval L4 que se distingue pela morfologia da vulva “crescente branca”(Figura 5E). Prepare populações de ovos sincronizados branqueando adultos gravid. Colete adultos gravid cheios de ovos lavando animais que crescem em uma placa de NGM. Para lavar, inunde a placa com 1 mL de tampão M9, encoste para cima e para baixo para coletar líquido com animais suspensos e tubo em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Animais de pelotas por assentamento gravitacional ou centrifugação suave com uma mini centrífuga e remover o supernatante. Adicione 150 μL de 5M NaOH e 150 μL de hipoclorito de sódio de 6% (alvejante) em 1 mL em H2O e misture por inversão por aproximadamente 5 minutos.NOTA: A solução de branqueamento fresco garante que a cutícula animal possa ser interrompida para a colheita de ovos. O progresso na interrupção da cutícula pode ser monitorado sob um microscópio dissecando; os adultos devem quebrar e liberar ovos no ponto em que o branqueamento deve ser interrompido. Centrifugar suavemente com um tubo de minicentrifuge por 20 s e remover o supernatante. Adicione 1 mL de tampão M9 e centrífuga novamente, deixando cerca de 100 μL em cima da pelota. Repita as etapas 4.2.3 duas vezes para remover traços da solução de alvejante. Resuspenque os ovos no volume restante e transfira para uma placa NGM semeada fresca. Os adultos serão lysed, mas muitos ovos viáveis devem estar na preparação. Prepare populações sincronizadas por ovo-lay cronometrado. Escolha 20 adultos gravid para uma placa NGM semeada usando protocolos de transferência padrão14. Permitir que os animais engatinham livremente e coloquem ovos por 1,5 h (cepas mutantes com baixos tamanhos de ninhadas podem exigir a introdução de mais animais adultos). Remova todos os animais adultos da placa colhendo, deixando a população de ovos sincronizados para trás. Verifique as placas algumas horas depois para verificar se nenhum adulto viável foi perdido durante a remoção de adultos. Prepare populações de ovos sincronizados por seleção de flutuação de sacarose de ovos. Recolher animais e ovos de cinco placas de NGM sobre as quais os animais gravid têm colocado ovos por pelo menos 24 horas inundando placas com solução M9 com detergente de 0,1% (como Tween 20 ou Triton X-100) e coletando em um tubo de 15 mL. Adultos de pelotas por centrifugação suave à temperatura ambiente (2.000 x g para 30 s). Remova os animais supernasceres e lave os animais em 15 mL de M9 fresco três vezes, descartando o supernascer após cada lavagem, certificando-se de manter a pelota enriquecida em animais e ovos. Retenha 2 mL de supernasce e resuspense a pelota. Adicione 2 mL de 60% de peso em volume de sacarose. Centrifugar a 2000 x g por 5 min. A solução agora exibirá uma fase superior altamente enriquecida em ovos. Transfira cerca de 2,5 mL da fase superior para um novo tubo de 15 mL e adicione 10 mL de M9. Misture por inversão por 1 min, e depois centrífuga 2000 x g por 1 min. Retire o supernatante e lave a pelota enriquecida com ovos em M9. 10-15 μL da pelota de ovo pode ser distribuído para uma placa NGM fresca OP50.semeada.NOTA: Este método prepara um grande número de ovos; não permitem que animais coletados corram dos alimentos OP50 E. coli. Prepare populações sincronizadas colhendo animais na fase L4 de desenvolvimento. Cultivar animais em placas de GNM semeadas como descrito acima.NOTA: C. elegans se desenvolvem em quatro estágios discretos. A 20 °C, um ovo recém-colocado leva cerca de 9 horas para eclodir (Figura 5A). Pós-eclosão, um animal passa pelo estágio larval 1 (L1) para o estágio larval 4 (L4), com cada estágio durando de 8 a 12 horas entre cada molt(Figura 5A-F). Portanto, um prato preparado por inoculação com ovos deve ter muitos animais L4 para colher cerca de 40 horas após a introdução dos ovos. Identifique animais encenados em L4 localizando a forma crescente de meia-lua branca da vulva em desenvolvimento (Figura 5E).NOTA: Os animais na fase L4 são uniformes em tamanho e na pigmentação corporal. Escolha animais com o crescente branco para uma placa de crescimento fresco para exame de animais encenados. No dia seguinte (~ 24 horas depois) deve ser contado como adulto dia 1. Marcar uma população de animais diariamente no dia adulto 2.NOTA: As exófilas são tipicamente pontuadas no segundo dia da vida adulta, que é o pico de produção de exopher em condições basais. No entanto, como o pico e o tempo da exofergênese podem ser deslocados por alterações ambientais ou genéticas que estão sendo estudadas, é aconselhável pontuar uma população de animais adultos diariamente durante quatro dias para gerar o quadro mais abrangente(Figura 3D). 5. Detecção de exófilos usando um microscópio fluorescente Observe exofers usando um microscópio de dissecação pseudo-estéreo de alta ampliação que é equipado para microscopia de fluorescência. Imobilize os animais em placas de NGM, tubulando 100-200 μL de 10-100 mMm levamisole/tetramisole solução na superfície da placa de Ágar NGM. Após 2-4 minutos, os animais ficam paralisados e podem ser observados diretamente na placa de ágar.NOTA: Os tratamentos de imobilização não são absolutamente necessários, de tal forma que com um olho treinado, identificação neuronal e presença exoferte pode ser pontuado seguindo visualmente animais rastejantes sob o microscópio na placa ao determinar se uma esferográfica foi ou não produzida. Observe neurônios fluorescentes usando uma ampliação total de 100x para realizar a dissecação de detecção de microscópio de exofers.NOTA: A pontuação de eventos de exópher usando microscopia de dissecção permite a observação de um grande número de animais com relativa facilidade diretamente nas placas de ágar nas quais são criados. Imagens ao vivo e montagem de repórteres para estudos de exópher usando microscopia confocal Use um microscópio confocal para dinâmicas intracelulares de imagem ao vivo e características da exofergênese.NOTA: A imagem ao vivo é uma abordagem vantajosa para observar detalhes sutis da produção de exóferos, pois a produção de exóferos é um processo dinâmico. Restringir o movimento animal para imagens vivas de alta resolução usando métodos convenientes, incluindo a utilização de levamisole ou tetramisole a 10-100 mM ou a aplicação de microesferas de poliestireno de hidrogel (com diâmetros de 15 μm, 30 μm ou 40 μm)18. Preparação de slides para microscopia composta e confocal Monte 20-50 animais em um agente imobilizador em um slide de microscópio. Lâminas de citologia anéis reutilizáveis pintadas com anéis elevados de 13 mm de diâmetro são úteis para a montagem. Escolha animais vivos em 5-20 μL de um paralítico como 10-100 mM de levamisole ou tetramisole dentro do círculo pintado ou no ágar pad. Aguarde 4 minutos para a paralisia e cubra o slide com um deslizamento (recomendo nº 11/2 (0,16 – 0,19 mm) ou nº 2 (0,17 – 0,25 mm). Montando um pequeno número de animais Não esmague animais montados; ao observar apenas alguns (menos de 20) animais por slide, há o risco de esmagar alguns dos animais devido à pressão desigual do deslizamento. Este risco pode ser minimizado usando uma almofada de agarose de baixa porcentagem para montagem. Faça um slide de almofada de 2-4% agarose e, em seguida, adicione 2-15 μL de solução paralítica ao bloco. Tenha em mente que levamisole e tetramisole se difundem no bloco, diminuindo sua concentração efetiva. Monte colhendo animais em uma gota de 2-15 μL de solução paralítica ou microesferas descansando sobre a almofada de ágar. Coloque a tampa em cima e verifique se os animais estão intactos18. Preparação do ágar pad Para preparar 2% de almofadas de ágar, aqueça 2% na solução M9 e micro-ondas até que a agarose esteja em estado homogêneo e derretido. Para alcançar um ágar pad de qualidade suficiente, alternar a mistura e micro-ondas em baixa potência por menos de 20 segundos. Evite a inclusão de bolhas de ar dentro da almofada colocando ágar fervente em um bloco de aquecimento e permitindo que as bolhas subam à superfície. Use uma pipeta Pasteur para extrair ágar das profundezas da solução derretida abaixo das bolhas levantadas. Prepare dois slides colados e coloque em ambos os lados de um microscópio de vidro limpo sobre uma superfície plana. Para fazer os slides gravados coloque duas tiras de 5 cm de fita de laboratório em cada slide(Figura 6A). Usando uma pipet Pasteur, coloque uma única gota de ágar sobre o slide de microscópio limpo entre os slides colados(Figura 6B). Com cuidado e rapidez, cubra a gota de ágar derretido com um quarto slide limpo, colocando-se entre os slides colados(Figura 6Cc).NOTA: O slide deve pressionar suavemente o ágar derretido em um círculo achatado com cerca de 0,4 mm de espessura (a espessura da fita)(Figura 6D). O ágar deve esfriar rapidamente. Remova o slide superior deslizando-o(Figura 6E). As almofadas de ágar secam rapidamente e são melhor usadas em poucos minutos. Uma vez que o slide superior seja removido, use a almofada de gel imediatamente para a montagem de animais. Evite usar almofadas com bolhas de ar. Armazene almofadas de ágar até 30 minutos envoltas entre as duas lâminas de vidro. Ágar seco faz com que os animais se despresem e dessfilam. Monte animais dentro de 2-15 μL de solução paralítica ou microesferas e cubra com tampa; tela do slide dentro de 20 minutos de paralisia e montagem(Figura 6).NOTA: Como as condições de estresse podem alterar as taxas de exófero, evite paralíticos que possam induzir estresse oxidativo (ex: azida de sódio) ao triagem para exófilos. Detecção de exóferos usando um microscópio confocal de disco giratório Observe características biológicas celulares, como organelas e outros conteúdos com objetivos de abertura numérica de 1,4 em 63x e 100x. Use software capaz de controle de palco e aquisição de imagens utilizando a aquisição multidimensional. Microscópios e software de processamento de imagens também devem ser adequados para a coleta de imagens e dados, pois essas etapas envolvem abordagens de imagem padrão. 6. Identificar neurônios de toque e pontuar para exófilos com animais montados Monte de animal adulto paralisado(Figura 6). Identifique o plano Z desejado. Utilize campo brilhante de baixa ampliação (10-40x) para identificar o plano Z adequado do animal, tomando nota do posicionamento do animal, orientação da cauda da cabeça e localização da vulva – que são marcos para posterior identificação neuronal e exófia(Figura 3A & Figura 5E). Concentre-se no sinal de fluorescência do repórter escolhido. Hospedando-se no mesmo plano Z, mude para fluorescência de campo largo visualizando em 10-40x para o repórter citosolico escolhido.NOTA: Neste exemplo, a expressão fluorescente é impulsionada pelo promotor mecanosensosenso-neurônio específico do MEC-4. Matrizes de cópias altas e fluoroforos diferentes têm variabilidade na expressão e, portanto, intensidade fluorescente variável. Ajuste se necessário. Role dentro do eixo Z para observar a profundidade do animal e expressão fluorescente no plano focal. Ao fazê-lo, confirme a orientação da cauda da cabeça; a cabeça/faringe terá o anel nervoso fluorescente e, neste caso, a cauda conterá somas PLM visíveis de 1 a 2(Figura 3A). Identificar neurônios de toque Identifique se o animal está montado no lado esquerdo ou direito(Figura 3A).NOTA: Considerando a tridimensionalidade do animal, a melhor resolução de imagem é realizada no lado mais próximo da óptica. Identificar a soma (ALM, ALMR, AVM) observando – comece pela cabeça para identificar o anel nervoso e os processos neuronais laterais. Na ampliação de 10-40x, role lentamente através do eixo Z para identificar o processo anexado. Uma vez identificado o processo, siga-o lateralmente na direção posterior em direção à vulva, onde a soma será aparente, marcada por um corpo celular redondo no final do processo. Uma vez encontrada a soma neuronal mais focal, ela pode ser identificada usando outros marcos neuronais da seguinte forma: Use o AVM, um neurônio ventral próximo, para ajudar a atribuir orientação animal. Se o neurônio AVM está no mesmo plano que a ALM, então o animal está descansando sobre seu lado e o neurônio fora desse plano é o ALMR . Se o neurônio AVM não estiver no mesmo plano que a ALM em questão, o neurônio de toque mais próximo do plano focal é a ALML. Identifique o neurônio PVM, outro neurônio de toque ventral localizado perto da cauda, para indicar se o neurônio de toque anterior está no mesmo plano. Se assim for, o neurônio de toque observado é ALML. Tenha uma noção da posição de outros corpos soma, perto da área de interesse (neurônios fluorescentes localizados em ambos os lados da soma), e em todos os Z-planes, mesmo que não seja possível obter o neurônio mais profundo definido em foco claro.NOTA: A identificação de todas as somas de neurônios de toque é importante porque soma fora de foco pode ser confundido com exofers. 7. Identificação e pontuação para exóferos Uma vez que um neurônio de toque é encontrado, inspecione-o para grandes saliências (domínios exopher) grandes o suficiente para ser considerado um exopher de bud, (atingindo pelo menos 1/5do tamanho da soma originária) (Figura 1C).NOTA: O exofere médio mede em torno de 2-8 μm de diâmetro, enquanto a soma média de um (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) mede 6-10 μm no dia 2 adultos(Figura 7B). Se não for observado nenhum domínio bud ou exopher, inspecione a soma neuronal para um filamento fino anexado emanando da soma. Exofers anexados tendem a ser localizados mais perto da soma originária e em um plano Z semelhante.NOTA: Nem sempre as exófilas permanecem ligadas à soma. A detecção de um filamento anexado é uma indicação definitiva de que o objeto é um exofer. Para identificar uma exofere não acontecido, procure o conteúdo de um exopher. Exóferos podem concentrar proteínas fluorescentes expelidas e, portanto, são muitas vezes mais brilhantes que a soma.NOTA: O conteúdo das exófilas é heterogêneo e variável. Organelas celulares como lysososomes e mitocôndrias também podem ser extrudadas dentro de exóferos(Figura 4C-E). Procure por exofers não ligados em diferentes planos focais do que o avião em que a soma originária foi encontrada. Embora as exofers tenham sido vistas a se projetar da soma alm em qualquer direção, é típico que as exoferidores se salientem longe da soma, em uma direção posterior do processo neuronal. Verifique se há objetos grandes e esféricos que não estão posicionados e identificados como somas neuronais. Exóferos podem ser irregularmente moldados, mas são estruturas tipicamente esféricas. As exóferas ficam degradadas com o tempo, então exófilos mais velhos tendem a ter uma forma mais irregular.NOTA: Exofers maduros ou mais velhos distinguem-se do estágio disperso de “noite estrelada” através da intensidade de fluorescência mais brilhante dos exophers e sua forma esférica. Investigue o fenótipo da “noite estrelada” como evidência de exofergênese anterior. Exophers avançam para um estágio de “noite estrelada” à medida que o exópher se divide em viasculas menores e a hipodermis circundante tenta degradar o conteúdo exopher(Figura 1G, 2B, 3B & 7A).NOTA: O palco noturno estrelado é marcado por entidades fluorescentes fragmentadas e dispersas (às vezes em rede) que perderam a integridade estrutural e exibem uma fluorescência fraca em comparação com os neurônios de toque e estruturas de exófias. Procure por exemplos de “múltiplos eventos de exopher”. Exóferos são geralmente produzidos como uma ocorrência singular (1 exopher emanando de 1 soma), mas em algumas circunstâncias mais de uma exófação pode ser liberada de uma única soma(Figura 7D).NOTA: As periferias maduras podem se degradar em múltiplas vesículas à medida que são degradadas na hipoderme. Distinguindo se cada exoferimento foi gerado por um evento de exofergênese independente ou se uma divisão exófero original para criar uma vesícula adicional só pode ser determinada pela observação de lapso de tempo. Tenha em mente que nem todas as anormalidades morfológicas amadurecem em exófações. Não marque uma soma distendida como um exopher. Uma soma estendida ou pontiaguda pode ser observada de vez em quando (especialmente com idade ou sob estresse), mas uma extensão sem um local de constrição claro não é pontuada como uma exófia. Rejeite pequenos botões resolvidos que não atinjam 1/5do tamanho da soma na quantificação de eventos exopher. Não conte os crescimentos de neurite como exophers. Os neurites maduros podem se estender dramaticamente com a idade (geralmente na direção oposta do processo neuronal) e a proteína fluorescente pode migrar para a extremidade distal dessas estruturas19.NOTA: Estes crescimentos neuritas não são exophers, pois têm um padrão de desenvolvimento distinto ao longo de dias e semanas, não formam botões e não se desprendem(Figura 7E). Identifique entidades fluorescentes que não sejam exofers.NOTA: É importante ter uma ideia de fluorescência de fundo para garantir a identificação correta da entidade fluorescente extrudada versus autofluorescência. Expressão fluorescente transgênica vs autofluorescência. Não confunda autofluorescência com expressão transgênica. O verdadeiro sinal de exofer não estará no intestino ou intestino (a confirmação dic pode ser usada para identificar esses tecidos) e o sinal de exoferer será significativamente mais brilhante do que a autofluorescência de fundo.NOTA: A autofluorescência é causada pela pigmentação fluorescente intestinal do grânulo intestinal e se acumula com a idade. É heterogênio, especialmente como visto com diferentes comprimentos de onda. Sinal de embriões. Não confunda sinal de embrião com exoferênese. Confirme as suspeitas de sinal de embrião mudando de fluorescência para iluminação de campo brilhante e verificando associações de sinal com ovos no útero. Fora do avião ou próximos corpos soma. Evite confundir uma soma fora do avião com uma exofer, identificando todos os corpos soma próximos, mesmo somas fora de foco no início da observação.NOTA: Se marcar para exophers da ALMR, identifique e responda a localização das somas AVM e ALMR. Mais detalhes sobre a identificação do corpo soma são descritos na Figura 3A. 8. Pontuação e estatística Pontuação exophers como binário (sim, há um exopher/não, não há um exopher). Considere a detecção de exóferos como um “evento de exófero” para um determinado neurônio. Um evento exopher pode constituir observação de um único exopher perto de uma soma ou exofers múltiplos.NOTA: Para quantificar os números de eventos de exoferênese individuais, use a observação de lapso de tempo. Conte eventos exopher por uma célula identificada em particular porque diferentes células não produzem exóferos na mesma taxa (ver, por exemplo, Figura 3C). Os neurônios ALMR produzem as exófações mais básicas nas cepas aqui descritas e, portanto, muitas vezes esta é a célula selecionada para quantificação exoraferora a partir de neurônios receptores de toque. Para as estatísticas, em geral, realizam pelo menos 3 ensaios biológicos, de pelo menos 30 animais pontuados por ensaio com o número correspondente de observações necessárias para análise da interrupção. Para múltiplos ensaios envolvendo um ou dois mutantes/tratamentos em comparação com o controle, o teste Cochran-Mantel-Haenszel é apropriado para determinar valores p. Para ensaios envolvendo mais de dois mutantes de tratamentos em comparação com o controle, também é apropriado usar uma análise de regressão logística binária para avaliar a significância de qualquer número de preditores categóricos.

Representative Results

Vários repórteres fluorescentes podem ser usados para medir exófias. Exóferos de neurônios sensíveis ao toque são facilmente visualizados in vivo através da marcação fluorescente de proteínas que podem ser selecionadas para extrusão, por rotulagem de organelas que podem ser extrudadas, ou marcando membranas celulares. A Tabela 1 identifica o neurônio de toque expresso repórteres fluorescentes que têm sido usados para monitorar exofers, com exemplos representativos incluídos na Figura 4. As cargas que são conhecidas por serem extrudadas em exófias incluem uma fusão do domínio n-terminal da huntingtin humana à poliglutamina expandida (Q128) (Figura 4B),lysososomes que são marcados por GFP com proteína de membrana associada à linssósômica (LMP-1)(Figura 4C)e mitocôndrias marcadas com GFP localizados em matriz (Figura 4D). O GFP citoplasmático não é fortemente expelido e é preferencialmente retido na soma5,embora o GFP possa visualizar fracamente exofers(Figura 4A). Quando o GFP é fundido a proteínas que são expelidas, esta tag pode ser usada para visualizar exofers. Um ponto importante é que, ao marcar diferentes proteínas, uma grande variedade de questões sobre a expulsão de cargas e organelas específicas, bem como sobre as proteínas e membranas que compõem exofers, pode ser abordada. Uma configuração pseudo-estereomicroscópio é uma ferramenta eficaz para visualizar exóferos em animais sobre placas de ágar. Esta configuração é um híbrido de tecnologia composta e estereoscópica que inclui alta óptica de abertura numérica em cada ampliação, tecnologia pseudo-estéreo (objetivos discretos sobre uma base estereoscópica) e um interruptor operacional zoom para visualização em ampliações intermediárias aos objetivos instalados. Um microscópio como este deve ser equipado com oculares 10x e objetivos poderosos o suficiente para observar a morfologia neuronal e a produção de exopher para pontuação de alto rendimento (objetivo de 2x usado para digitalização/colheita, objetivo de 10x usado para identificação e pontuação). Embora as capacidades de ampliação dos estereóscópios padrão tipicamente tenham alta resolução suficiente para ver a rede de neurônios sensíveis ao toque expressando proteínas fluorescentes, microscópios de dissecação padrão não são suficientes para observar detalhes subcelulares de exóferos como as conexões tubulares de soma a exopher. Tais observações exigem microscopia confocal (consulte a Tabela de Materiais para detalhes do equipamento). Estudos de quantitação exopher requerem controles rigorosos para eliminar estresses experimentais. A manutenção atenta de condições consistentes de crescimento é necessária para a produção de exóferos reprodutíveis. Mais especificamente, a produção de exóferos é responsável pelo estresse, de forma que a alimentação consistente, a temperatura constante e o crescimento livre de contaminação entre gerações são fundamentais para a reprodutibilidade. Sob condições de crescimento basal com alta expressão neuronal de mCherry, a produção de exóferos é relativamente baixa (5-25% de ALMRs produzem exofers), mas algumas tensões, incluindo estresse osmótico e oxidativo, podem aumentar as taxas de exófero. Embora a expressão mCherry possa ser considerada como estresse, um corolário da sensibilidade ao estresse dos níveis de exófero é que, se devidamente controlada, a introdução experimental do estresse pode ser uma estratégia para induzir e observar mais facilmente exofergênese. Tempos e níveis de produção de exofer antecipados. Exofers estão praticamente ausentes durante o desenvolvimento larval. O período de pico de produção de exóferos na vida adulta jovem parece ser altamente restrito durante os dias adultos 1-4, sendo mais comumente evidente no dia adulto 2 ou 3. Como o pico pode mudar um pouco para frente ou para trás, a avaliação mais completa de um perfil de produção exopher é marcar vários testes diariamente durante os dias adultos 1-4. Em geral, uma ALMR produz uma grande exófia, com a vesícula persistindo por pelo menos 24 horas. O exopher pode ser produzido rapidamente (na ordem dos minutos no seu mais rápido). Mais comumente, apenas uma grande exófia é produzida por neurônio no início da vida adulta, mas a produção de exóferos múltiplos é possível. Em geral, a produção de exopher por ALMRs expressando mCherry em condições basais varia de 5 a 25% das ALMRs examinadas dentro do prazo ideal do dia adulto 2-3(Figura 3D). Crises de proteostase5,bem como exposição a outras tensões podem modular o nível de exófero. O estresse ou perturbações genéticas podem aumentar a produção de exóferos para taxas de detecção tão altas quanto 90% dos neurônios ALMR produzindo extrusões exóferos. RNAi baseado em alimentação para testar funções de genes específicos na exoferênese. O nematode C. elegans é comumente submetido a rnai knock down por animais de alimentação transformados E. coli tensão HT115 que expressam um RNA duplo encalhado (dsRNA) visando um gene de interesse20. Bactérias HT115 podem ser usadas na pontuação de exóferos na alimentação RNAi5. Enquanto as transcrições na maioria dos tecidos podem ser alvo da RNAi usando essa técnica, os neurônios são mais refratários. A sensibilidade ao RNAi pode ser calibrada usando animais que expressam o transporte transgênico dsRNA SID-1 sob um promotor específico de neurônios. Desta forma, o tecido neuronal pode ser sensibilizado para a RNAi21. A derrubada específica do tecido de um gene de interesse pode ser realizada expressando um componente do metabolismo rnai endógeno dentro de um mutante que é deficiente nesse componente. Por exemplo: a proteína Argonaute RDE-1 pode ser expressa especificamente nos neurônios de animais mutantes rde-1 para alcançar a derrubada de um gene de interesse apenas em neurônios quando os animais são expostos a uma intervenção RNAi visando esse gene. Utilizando os protocolos padrão nematode RNAi20,22, exposição dos pais na fase L4 ao RNAi e permitindo que sua prole desenvolva bactérias HT115 transformadas até a idade adulta gera a forte derrubada genética, mas esteja atento a potenciais atrasos no desenvolvimento induzidos pela RNAi, pois animais experimentais podem crescer de forma diferente de um controle de vetores vazio. É importante incluir sempre o controle de vetor vazio para comparação de controle negativo. As bactérias HT115 podem ser usadas na pontuação para exóferos na alimentação rnai. No entanto, note que alguns genes são eficazes na mudança das taxas de exofergênese mesmo durante períodos mais curtos de exposiçãornai 5. Se o alvo de certos genes levar a uma falha no desenvolvimento, evite expor animais a knockdown ao longo da vida, os animais podem simplesmente ser colhidos no estágio L4 em placas RNAi para exposição de L4 a D2 ou D3 adultos. Nome da cepa Genótipo Descrição Porcentagem de exopher Referência SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] Expressão citosóica de GFP em neurônios de toque. 1-8% ALM Figura 4A, Melentijevic 2017 ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry] A superexpressão do mCherry (bzIs166) em neurônios de toque, produz tanto o sinal citosolico quanto os agregados mCherry. bzIs166 é um indutor exópher. os agregados mCherry são preditores de exofergênese e são preferencialmente extrudados em exóferos. 3-20% ALM (condições normais). 20-80% ALM (condições de jejum). Figura 4B, Melentijevic 2017 ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; YFP citosolicamente rotula neurônios de toque mec-7. Co-expresso Q128::CFP agrega e induz exofers. CFP preferencialmente silencia. ~25% Figura 4C, Meletijevic 2017 ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] bzIs168 LMP-1::GFP rotula membranas plasmáticas e membranas lysosômicas. bzIs168 pode ser usado para identificar membranas neuronais, exófias (como são ligadas à membrana) e estruturas de membrana lysosômica. 3-20% ALM Figura 4D, Melentijevic 2017 ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] Allele zhsEx17 é um repórter mitocondríicamente localizado que muda seu comprimento de onda de excitação de 405nm (oxidado) para 476nm (reduzido) de acordo com o ambiente oxidativo local. É expresso nos neurônios de toque e pode ser usado por conta própria para identificar mitocôndrias em neurônios de toque e em mito-exophers. 3-20% ALM proteo-exopher. % ALM mito-exopher quantitação em andamento. Figura 4E, Melentijevic 2017, Cannon 2008, Ghose 2013 Mesa 1. Cepas que têm sido usadas para visualização de neurônios sensíveis ao toque, visualizadores de neurônios e conteúdo exopher. Figura 1: Estágios da Exoferênese. O processo de fazer e ejetar um exofer é chamado de “exófé-gênese”. O processo dinâmico de formação de exóferos pode levar vários minutos a várias horas. São retratados exemplos de morfologia soma e exópher em etapas específicas durante o processo de exofergênese dinâmica em uma cepa produtora de alta exófação, ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Todas as imagens são do dia 2 neurônios adultos da ALM tiradas com um objetivo de 100x. (A) Soma normal. Neurônio de toque mecanosensrial adulto ALM expressando transgenicamente Pmec-4mCherry. A morfologia soma retratada é típica de neurônios adultos jovens nesta cepa, com concentrações mCherry no citoplasma. (B) Fase do bud precoce. O primeiro passo observável da exofergênese envolve a polarização do material citoplasmático selecionado à borda da membrana soma. Esta etapa é frequentemente acompanhada de uma expansão ou inchaço da soma. No caso dos neurônios de toque, o domínio pré-exofer (PED) se estende para a hipodermis circundante (não visível aqui). Observe a maior concentração do material mCherry no domínio do bud inicial. (C) Fase do broto tardio. Após mais polarização celular e uma expansão do domínio pré-exopher, uma constrição entre a soma e a exofer (seta) torna-se evidente. Este evento sinaliza a transição para a fase do bud tardio. Embora no estágio final do bud a célula exibe um local de constrição claro e domínios separados soma e exopher, ele ainda não está completamente afastado da soma; o exopher brotante pode ser anexado por um talo grosso (seta). O domínio brotante é considerado uma exofereção precoce quando o diâmetro do domínio exopher em questão é aproximadamente 1/3 maior do que o diâmetro do canteiro de obras/talo. (D) Fase de exofer early.exopher. Os exóferos precoces podem ser anexados por um talo da soma de partida — o diâmetro dessa conexão pode diminuir à medida que o exópher se afasta da soma. O material citoplasmático pode ser transferido da soma para o exopher através deste tubo, embora a maioria do material seja carregada durante o processo de brotação. Os exóphers podem separar-se da soma como retratado em(E),exófias separadas são consideradas exóferas maduras(F). A exofer madura pode transitar através do tecido hipodérmico circundante, afastando-se da soma de partida. (G) A quebra da exófera rotulada por mCherry em vesículas menores dentro da hipodermes resulta em uma aparência pontuada dispersa do material mCherry, provavelmente quando entra na rede endolíssomal hipodérmica. O sinal de pontuação disperso é chamado de fase “noite estrelada”. A degradação de alguns conteúdos exóferos é provavelmente realizada por lisesomos hypodérmicos, mas algum material não é totalmente degradado e muitas vezes é re-extrudido pela hipodermes no pseudocoelom. O trânsito pós-exophergenesis mCherry é descrito com mais detalhes na Figura 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: mCherry extrudido de neurônios de toque em exóferos envolve a rede hipodérmica lysosômica circundante, mas pode depois ser extrudado no pseudocoeloma onde coelomócitos podem armazenar/degradar o mCherry. (A) Resumo do desenho animado de como mCherry extruded em exófias transita pelo corpo após expulsão por neurônios. Durante a exofergênese, conteúdos celulares selecionados como mCherry tornam-se localizados e brotam da soma neuronal em uma vesícula independente cercada pelas membranas plasmáticas neuronais e hipodérmicas. Uma vez que os neurônios de toque estão incorporados no tecido hipodérmico, à medida que o domínio exófero se move para fora, ele se move ainda mais para a hipodermis. A exófera pode transitar pela hipodermis, e depois de horas a dias, o conteúdo exofer pode se fragmentar dentro da rede endolíssóica da hipodermes. O mCherry pode aparecer como puncta disperso por toda a hipodermis, um palco chamado “noite estrelada”. Depois de alguns dias, alguns dos mCherry podem passar para fora da hipoderme para o pseudocoelom circundante, onde células de catadores chamadas coelomócitos podem ter acesso, e assumir, mCherry que pode ser armazenado. (B) Exemplo da aparição das vesículas noturnas estreladas. Imagem de uma soma ALM marcada com mCherry com grandes fragmentos exopher e vesículas noturnas estreladas. A cepa é ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. (C) Exemplo de concentração de mCherry em coelotócitos distantes. Visão lateral de um animal adulto dia 10 de cepa ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] mostrando mCherry concentrado em coelomócitos (setas). Algumas vesículas noturnas estreladas também são evidentes. Em geral, a concentração de coelomócitos torna-se evidente após cerca de um dia adulto 5 de vida. (B fundo) Reprodução de desenho animado de (B), com neurônios de toque e processos delineados em vermelho, assim como fragmentos mais brilhantes exopher; pequenas vesículas espalhadas de diferentes profundidades Z são mostradas em rosa mais claro. (C fundo) Versão em desenho animado da imagem de (C), mostrando processo neuronal em vermelho, noite estrelada em rosa e coelotócitos em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Os neurônios de toque mecanosensorial produzem exófilos em diferentes níveis com um perfil temporal preciso. (A) (Topo) Representação de desenho animado de neurônios de toque mecanossensoriais em relação espacial aos principais marcos anatômicos de C. elegans, incluindo a faringe de bombeamento e o anel nervoso denso neurônio na cabeça do animal, a vulva no corpo médio e a cauda afilada. (Inferior) Neurônios de toque fluorescente rotulados expressando GFP como visualizados do lado superior e esquerdo (imagens adaptadas de WormAtlas). A caixa vermelha retrata a área onde as exofers alm estão tipicamente localizadas. (B) Visão de alta ampliação da região do corpo médio em que as periferias derivadas da ALM são produzidas em uma cepa expressa [Pmec-4mCherry]. O neurônio AVM e ALMR são retratados, e mostrado é um exopher ALMR juntamente com mCherry noite estrelada. Os neurônios ALMR produzem mais facilmente exófias. (C) Os neurônios de toque mecanosensoriares da ALMR produzem mais facilmente exófações em comparação com outros neurônios sensíveis ao toque em hermafroditas em condições basais. A produção de exófife de neurônios de toque mecanosenso no dia 2 adulto, como indicado para neurônios receptores de toque individuais é indicado. Tensão: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, barras de erro são SEM. (D) Os neurônios de toque ALMR produzem mais exofers durante os dias 2 e 3 da idade adulta em comparação com o estágio L4 adolescente ou com animais em idade avançada. Tensão: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], N>150, barras de erro são SEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número. Figura 4: Exemplos de alguns repórteres fluorescentes que marcam conteúdo exopher. Uma maneira simples de observar exofers é criando animais transgênicos que expressam fluoroforos de promotores neuronais. Os fluoroforos permitem a visualização da expressão exófera e transgênica induz a agregação e/ou proteostresss que aumenta a exofergênese. Exóferos produzidos por neurônios anfóides também podem ser observados em condições nativas, utilizando preenchimento de corante para visualização. São mostrados exemplos de cepas comuns que podem ser usadas para observar exóferos, (E) exopher, (S) soma. (A) Soma e exopher de uma ALM de um adulto de cepa SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP],100x objetivo usado para fotografia, barra de escala 3μm. Nesta cepa, exófias que incluem GFP solúvel são medidas, mas a produção exofer ocorre com pouca frequência. Fundir gfp a proteínas que podem ser preferencialmente extrudadas em exóferos em outros estudos confirma que as fusões de GFP podem ser detectadas em exófias maduras. (B) ALM soma e exopher de um adulto de cepa ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry], que expressa mCherry e induz a produção de exopher de neurônio de toque. 100x objetivo utilizado para fotografia, barra de escala 5 μm. (C) ALM soma e exopher de um adulto de cepa ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; canal azul seletivo usado para imagem de htt57Q128::CFP. O exopher contém agregados htt57Q128::CFP (setas), que aparecem mais concentrados na exófação do que na soma. 40x objetivo utilizado para fotografia, barra de escala 5μm. (D-E) Exofers podem conter organelas e marcação específica de organela com proteínas fluorescentes permite o monitoramento da extrusão organela. (D) A etiqueta de membrana lysosômica LMP-1::GFP descreve a membrana soma e exófia e marca as membranas plasmáticas fracamente (a localização da membrana plasmática é um passo de tráfico no caminho para o direcionamento líssômico) e rotula organelas lysosômicas fortemente. Mostrado é um adulto ALM soma co-expressando Pmec-4mCherry e o Pmec-7LMP-1::GFP que localiza para membranas e lisesósmos. A soma tem uma exofere anexada com outras extrusões menores que provavelmente são fragmentos de exópher (setas). As estruturas positivas do GFP estão incluídas na soma e estão presentes na grande exófia, cepa: ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1:::GFP]. 100x objetivo utilizado para fotografia, barra de escala 5 μm. E) Um marcador GFP mitocondrial pode ser usado para identificar mitocôndrias em soma e exófias. Mostrado é uma soma de ALM adulto expressando Pmec-4mCherry e mito::ROGFP, que se localiza para a matriz mitocondrial. mito::ROGFP expresso sozinho, sem o mCherry, também pode ser facilmente usado para identificar neurônios e pontuação para exófilos que incluem mitocôndrias. Tensão: ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]. 100x objetivo utilizado para fotografia; barra de escala 5μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Ciclo de desenvolvimento de C. elegans e identificação L4. A (A) A 20 °C um ovo leva aproximadamente 9 horas para eclodir uma vez colocado pela mãe. (B) Um animal recém-eclodido está no estágio larval 1 (L1) e se transforma em uma larva L2 após 12 horas. (C) Os animais permanecem nos estágios larvais L2 e L3 (D) por cerca de 8 horas cada. (E) Os animais adolescentes são considerados o quarto estágio larval (L4) e são marcados por uma vulva em desenvolvimento visível que aparece como uma crescente branca perto do corpo médio. A presença disso enquanto crescente permite fácil identificação e colheita de animais encenados L4 para estabelecer culturas sincronizadas que mais tarde facilitam a pontuação para exóferos. Os animais permanecem na fase L4 por cerca de 10 horas antes de sua fusão final em adultos gravid, F) identificados pelo desenvolvimento de óvulos, espermatozoides visíveis e o início da colocação de óvulos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Preparação de microscópio slide agar pad. (A) Prepare dois slides com uma única tira de fita de laboratório colocada longitudinalmente em toda a parte superior. Coloque um slide de microscópio não colado no meio da foto. B) Coloque uma gota de agarose derretida em cima do slide. (C) Coloque um slide limpo suavemente em cima da gota, pressionando a agarose em uma almofada de círculo deflacionada. (D) Remova os slides colados, que atuam para realizar um achatamento uniforme do ágar necessário para criar uma almofada uniforme. (E) Remova o slide superior uma vez que a almofada de agarose tenha secado. (F) Pipeta uma solução paralítica (levamisole ou tetramisole) em cima da almofada de ágar. (G) Escolha animais devidamente encenados no paralítico. (H) Cubra delicadamente os animais com uma mancha de cobertura e garanta que os animais estejam vivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Personagens de exophers e critérios de identificação exopher. (A) Critérios gerais que identificam uma esferofera. (B) Comparações de diâmetro entre o envio soma e o exempatrofado extrudado, medido em μm. Somas de ALM adulto, N=35, cepa: ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] – 6,53 μm tamanho médio de soma e 3,83 μm tamanho médio de exopher. (C) Definindo critérios para diferenciar entre um domínio exopher e uma exofere brotante. (D) Mais comumente, os neurônios individuais fazem uma grande exófera, que mais tarde se divide ou fragmenta à medida que a hipoderite tenta degradar seu conteúdo. Ainda assim, várias exóferas podem ser observadas ao lado de um neurônio sensível ao toque que pode derivar de múltiplos eventos exópher de um neurônio ou, alternativamente, exofers também podem bud ou fragmentar-se. A origem de múltiplas entidades semelhantes à exofere só pode ser determinada usando microscopia de lapso de tempo. Top retrata um neurônio de toque ALMR soma com um único exofere distante. O fundo retrata um alvor de almoxamo soma com múltiplas extrusões semelhantes a exófias. (E) Características morfológicas comuns em somas de neurônios de toque de ALM adultos que podem ser confundidas com eventos exópher. Canto superior esquerdo – Uma soma ALM distendida, sem domínio ou local de constrição de esfolação claro. Meio superior – Os neurônios podem ter pequenas saliências extracelulares que podem ser análogas às exofers, mas não atendem aos critérios de exigência de tamanho para serem considerados uma exoferição. Superior direito – Com a idade, os neurônios de toque podem desenvolver crescimentos ao longo de sua neurita menor. Muitas vezes o material mCherry pode ser coletado na ponta do crescimento neurite. Isso não é pontuado como um exopher se o mCherry coletado não atender aos requisitos de tamanho exopher-to-soma. O fundo retrata neurônios adultos da ALM que têm critérios definidores para um domínio exopher ou um exopher. Botom esquerda – ALM soma que tem um domínio exopher proeminente que inclui seletivamente mCherry cytosol e mCherry marcado agregados. O site de constrição de domínio exopher é marcado por setas e atende aos critérios de tamanho (pelo menos 1/5do tamanho da soma). O maior diâmetro do domínio exopher é quase 1/3 maior que o diâmetro do local de constrição, atendendo aos critérios para um evento exopher. Meio inferior – ALM soma que tem um exopher brotante proeminente que atende aos critérios de tamanho. Há um local claro de constrição. Canto inferior direito – A ALM soma que tem uma exopher cheia de mCherry que atende aos requisitos de tamanho exófero. O exopher é anexado por um filamento de conexão fino. Todas as imagens são da cepa ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A caracterização dos mecanismos moleculares in vivo de eliminação de organelas agregadas e organelas na forma de grandes esferoféricos está em sua infância. Questões quanto à designação de cargas para expulsão, à coleta polarizada dessas cargas dentro da cela, à regulamentação da decisão de geração de exófilos, ao maquinário que media extrusões e à interação das exófilos com as máquinas degradativas em uma cela vizinha. Além disso, a visualização in vivo de conexões tubulares que podem passar materiais biológicos que incluem cálcio, agregados e mitocôndrias é interessante e subestudada biologia por si só. Questões de por que certas células são mais propensas a exopher produção do que outras também não são resolvidas, mas podem começar a ser geneticamente dissecadas com as abordagens descritas neste protocolo.

Descritas detalhadamente neste protocolo estão as abordagens para alcançar a pontuação reprodutível da produção de exóferos, com atenção à distinção de exóferos de somas celulares próximas, tempo de análises para capturar o pico de produção de exóferos e controle rigoroso das condições de crescimento para eliminar tensões não intencionais que podem modular níveis de exóferos. Tanto a distinção do grande exofer, quanto a “noite estrelada” dispersão na hipodermis circundante pode ser quantificada como evidência da produção de exóferos. Dito isto, os neurônios que expressam mCherry em condições basais estão mais frequentemente associados com 5-25% dos neurônios de um tipo específico produzindo uma exófia. A introdução controlada de condições de estresse poderia ser aplicada para aumentar a produção de exófação até 90% dos neurônios que produzem extrusões, particularmente úteis para telas genéticas ou farmacológicas para modificadores.

Na doença neurodegenerativa humana, grandes agregados podem ser transferidos de neurônios doentes para células vizinhas para promover a disseminação patológica. O mecanismo de exófero pode ocorrer através de um mecanismo conservado usado para extrusão agregada através de filos. Definir as moléculas in vivo que melhoram a eficiência desse processo (considerado controle mais eficaz da proteostase) ou bloqueiam pode ser aproveitado para influenciar o desenho de novas estratégias de combate a múltiplas doenças neurodegenerativas. Como tal, o protocolo descrito aqui poderia ser usado para telas de mutagênese genética clássica, telas RNAi em todo o genoma que sistematicamente derrubam genes para identificar melhoradores e supressores, ou para estudos de intervenção medicamentosa que identificam modificadores farmacológicos candidatos desse processo. A abordagem é simples, embora um pouco trabalhosa. As exóferas são tão grandes que podem ser vistas com um microscópio dissecando alta ampliação. Ainda assim, os neurônios C. elegans são relativamente pequenos e olhar para suas organelas ou suas membranas requerem imagens confocal de maior potência e é um processo lento. Opções para maior rendimento podem envolver abordagens de imagem de alto conteúdo em formato de placa multi-bem.

A aplicação de uma abordagem padronizada para a pontuação exófia deve fundamentar uma dissecção genética concertada do processo pelo qual os neurônios podem organizar e eliminar detritos celulares.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos as seguintes subvenções do NIH: R01AG047101 e R37AG56510. Membros dos laboratórios Driscoll e Grant contribuíram extensivamente para o desenvolvimento e ajuste fino dos protocolos descritos, com experimentos rigorosos e forte comunicação.

Materials

95B Scientific CMOS camera Photometrics Prime
1,000 μL low retention tips Sarstedt
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
absolute ethanol Vwr 20821.33
Agar Sigma Aldrich A1296
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
FBS10 Standard microscope Meyer Instruments KSC 410-1-100-1 FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
LDI – Laser Diode Illuminator 89 North
levamisole Sigma Aldrich 16595-80-5
M4 multipette Eppendorf 4982000012
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
pipeteboy 2 VWR 612-0927
Polystyrene microbeads Sigma Aldrich MFCD00131491
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
Reusable ringed cytology slides ThermoFisher Scientific 22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] contract Driscoll lab GFP expressed in touch neurons
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
Triton-X Thermofisher scientific 28313
Tween 20 Sigma Aldrich 9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] contract Driscoll lab mCherry expressed in touch neurons
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] contract Driscoll lab Q128 expressed in touch neurons
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] contract Driscoll lab mitoROGFP expressed in touch neurons
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] contract Driscoll lab autophagy marker expressed in touch neurons
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Riferimenti

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Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. J. Vis. Exp. (163), e61368, doi:10.3791/61368 (2020).
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