Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique
Summary
Présenté ici est un protocole pour l’infection de Pseudomonas aeruginosa et l’application de thérapie de phage dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (CF).
Abstract
La résistance aux antimicrobiens, une conséquence majeure de l’incertitude diagnostique et de la surprescription antimicrobienne, est une cause de plus en plus reconnue d’infections graves, de complications et de mortalité dans le monde entier, avec un impact énorme sur notre société et sur le système de santé. En particulier, les patients dont le système immunitaire est affaibli ou qui souffrent de pathologies préexistantes et chroniques, comme la fibrose kystique (FK), sont soumis à des traitements antibiotiques fréquents pour contrôler les infections par l’apparition et la diffusion d’isolats multirésistants. Par conséquent, il est urgent de s’attaquer aux thérapies alternatives pour contrer les infections bactériennes. L’utilisation de bactériophages, ennemis naturels des bactéries, peut être une solution possible. Le protocole détaillé dans ce travail décrit l’application de la thérapie de phage contre l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de zebrafish de CF. Les embryons de poisson zèbre ont été infectés par P. aeruginosa pour démontrer que la thérapie par phage est efficace contre les infections à P. aeruginosa, car elle réduit la létalité, la charge bactérienne et la réponse immunitaire pro-inflammatoire chez les embryons atteints de FK.
Introduction
La thérapie par phages, l’utilisation des ennemis naturels des bactéries pour combattre les infections bactériennes, suscite un regain d’intérêt à mesure que la résistance bactérienne aux antibiotiques segénéralise 1,2. Cette thérapie, utilisée depuis des décennies en Europe de l’Est, pourrait être considérée comme un traitement complémentaire aux antibiotiques dans le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de FK et une alternative thérapeutique possible pour les patients infectés par des bactéries qui sont résistantes à tous les antibiotiquesactuellement utilisés 2,3. Les avantages de la thérapie antibiotique sont que les bactériophages se multiplient au site de l’infection, tandis que les antibiotiques sont métabolisés etéliminés du corps 4,5. En effet, l’administration de cocktails de phages virulents isolés dans différents laboratoires s’est avérée efficace dans le traitement des infections pseudomonas aeruginosa chez des modèles animaux aussi différents que les insectes et lesmammifères 6,7,8. Il a également été démontré que la thérapie par phages était en mesure de réduire le fardeau bactérien des brûlures infectées par P. aeruginosa et Escherichia coli dans le cadre d’un essai cliniquerandomisé 9.
Zebrafish (Danio rerio) a récemment émergé comme un modèle précieux pour étudier les infections avec plusieurs agents pathogènes, y compris P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abccessus et Burkolderia cepacia12,13. En microinjectant les bactéries directement dans la circulation sanguine de l’embryon14, il est facile d’établir une infection systémique qui est contrecarrée par le système immunitaire inné du poisson zèbre, qui est évolutif conservé avec des neutrophiles et la génération de macrophages similaires à la contrepartie humaine. En outre, au cours du premier mois de vie, les embryons de poisson zèbre n’ont pas la réponse immunitaire adaptative, ce qui en fait des modèles idéaux pour étudier l’immunité innée, qui est le mécanisme de défense critique dans les infections pulmonaireshumaines 15. Zebrafish a récemment émergé comme un système de modèle génétique puissant pour mieux comprendre l’apparition des FC et de développer de nouveaux traitements pharmacologiques10,16,17. Le modèle cf zebrafish de cftr knock-down généré par injection de morpholino chez le poisson zèbre présentait une réponse d’éclatement respiratoire amortie et une diminution de la migration des neutrophiles10, tandis que le knock-out cftr conduit à une altération de la position interne des organes et à la destruction du pancréas exocrine, un phénotype qui reflète la maladie humaine16,17. Le plus grand intérêt était la conclusion que la charge bactérienne de P. aeruginosa était sensiblement plus élevée dans cftr-perte-de-fonction embryons que dans les contrôles à 8 heures après infection (hpi), qui fait le parallèle avec les résultats obtenus avec des souris et des cellules épithéliales bronchiqueshumaines 2,18.
Dans ce travail, nous démontrons que la thérapie de phage est efficace contre des infections de P. aeruginosa dans les embryons de zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous avons décrit le protocole pour effectuer l’infection de P. aeruginosa (PAO1) dans les embryons de poisson zèbre et comment appliquer la thérapie de phage avec un cocktail de phages précédemment identifiés comme capables d’infecter PAO1 pour le résoudre. L’utilisation de bactériophages comme alternative aux traitements antibiotiques est de plus en plus intéressante depuis quelques années. Cela est principalement dû à la diffusion d’infections bactériennes multirésista…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation italienne de la fibrose kystique (FFC#22/2017; Associazione « Gli amici della Ritty » Casnigo et FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
Riferimenti
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