カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降

1. ワームサンプルコレクション 種子混合ステージまたは必要な温度でNGM固体プレート上の13ワームを同期させ、ワームが所望の段階まで成長することを可能にする。基本的なC.エレガンスの成長とメンテナンスについては、Stiernagleらおよびポルタ・ド・ラ・リヴァら14,13を参照してください。 M9バッファーでワームプレートを洗浄することにより、15 mLの円錐遠心管にワームを収集します。 ペレットは、室温(RT)で400xgで2分間遠心して虫を捨て、上清を捨てる。注:抽出の準備のためのワームペレットのサイズは100 μLから500 μLの間です。パックされたワームの300 μLのペレットは下流の免疫沈降実験に推奨され、通常は総タンパク質の約4.5mgを生み出し、500 μLペレットは総タンパク質の約7.5mgを生み出します。 M9 バッファを使用して 3 ~ 5 の追加のステーブルを実行するか( 表 1を参照)、または上清が曇りでなくなるまで実行します。 ddH2Oで1回の最終洗浄を行います。 緩いワームペレットを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移動し、RTで400 x g で2分間スピンダウンします。残りの上清を捨ててパックされたワームペレットを得て、抽出調製に進む。注: プロトコルはここで一時停止することができます。ワームペレットは、液体窒素中ですぐにフラッシュ冷凍し、−80°Cまたは液体窒素で保存することができる。ワームペレットは一度だけ解凍でき、再凍結することはできませんのでご注意ください。 2. 虫ペレットの抽出準備 注:抽出物の調製は、氷上または4°Cで行う必要があります。 凍結した場合は、氷の上にワームペレットを解凍します。注:サンプル採取中に300μLの所望のパックされたワームペレットサイズが得られなければ、さらなる抽出のために十分な材料が存在するまで、複数の小さいペレットを組み合わせることができます。 氷冷2xリシスバッファー(60 mM HEPES、pH = 7.4、100 mM塩化カリウム、0.1%トリトンX、4 mM塩化マグネシウム、10%グリセロール、RNase阻害剤を有する2mM DTT、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤 を参照)およびvtexasase阻害剤を均等に添加します。チューブを下に回転させ、チューブの下部に混合物を集めます。 金属ビーズを含む1.5 mL RNaseフリーチューブに混合液を移動し( 材料表を参照)、4°Cのビーズミルホモジナイザー( 材料表を参照)にサンプルを入れます。 チューブキャップが締め付けられており、サンプルがホモジナイザー内でバランスが取れていることを確認します。 最高速度(設定12)で4分間、サンプルを均質化します。 ビーズからサンプルを取り出し、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ。あるいは、ホモジナイザーを備えた磁石を使用して、サンプルからビーズを除去することができる。 4°Cで20分間19,000xgで抽出物をスピンダウンし、タンパク質抽出物を明確にします。 上清を氷上の新鮮な1.5 mLチューブに移し、サンプルの上に形成される白い曇りの沈殿物の持ち越しを避けます。上清は現在、明確化された抽出物です。注:全タンパク質濃度を決定するために、明確化された抽出物の10 μLを保存します。 次の実験に直ちに抽出物を使用するか、液体窒素中の抽出物をフラッシュフリーズし、-80°Cで保存してください。注: プロトコルはここで一時停止される場合があります。抽出物は、超低温(-80°C冷凍庫または液体窒素〜6ヶ月間)で保存することができます。凍結抽出物は一度解凍され、再凍結することはできません。 メーカーの指示に従って、洗浄剤と互換性のあるタンパク質濃度アッセイキット( 材料表を参照)を使用して、抽出物の総タンパク質濃度を決定します。 3. 免疫沈降 注:抽出物調製のためのすべての免疫沈降ステップは、氷上または4°Cで行う必要があります。 各免疫沈降に対して2mgの総タンパク質を使用することが推奨されます。しかし、0.8~1mgの全タンパク質を用いた免疫沈降が成功している。常に新鮮なまたは解凍したタンパク質抽出物を使用してください。以下のプロトコルは、2mgの全タンパク質から免疫沈降を行う、または単一の免疫沈降実験を行う方法について概説する。ビーズおよび抗体の量は、複数のサンプルに対して、または異なる量のタンパク質抽出物が使用される場合に、それに応じて増加または減少し得る。 タンパク質抽出物を氷の上に置くか解凍します。試料は、氷冷1xリシスバッファーで10mg/mLまたは5mg/mLに希釈することができる( 表1参照)。 反転によって磁気ビーズを再中断し、50%ビーズ懸濁液の150 μLを1.5 mLチューブに移します。1分間、または溶液が透明になるまで、氷上のビーズを磁気スタンドにマグネティックします。上清を捨てます。 マグネットスタンドからチューブを取り出し、ビーズスラリーの2つのボリューム(すなわち、300 μL)を使用して1xのリシスバッファーでビーズを洗浄します。洗浄を2倍にして、合計3回の洗浄を繰り返します。 150 μL の氷冷ライシスバッファーでビーズを再懸濁します。 75 μLのビーズスラリーを2mgのタンパク質抽出物に移し、4°Cで1時間、穏やかな攪拌でインキュベートします。後で使用するために氷の上に残りのビーズサスペンションを保存します。注:このステップは、免疫沈降工程中にビーズに対する非特異的タンパク質結合を低減するために行われます。 サンプルを入れたチューブを氷の上の磁気スタンドに1分間置くか、ビーズが完全に磁化されてサンプルが透明になるまで置きます。上清を新しい1.5 mLチューブに移します。ビーズを邪魔しないでください。これは、予めクリアされたタンパク質のライセートです。ウェスタンブロット分析のためにサンプルの10%を保存します。 20 μgのアフィニティー精製抗体を予めクリアしたライゼートに加え、穏やかな攪拌で4°Cで1時間インキュベートします。注:免疫沈降に使用される抗体の量は、抗体およびタンパク質に特異的であり、標的タンパク質の有効な免疫沈降を確実にするために経験的に決定されるべきである。 洗浄済みビーズ懸濁液の残りの75μL(ステップ3.5)を抗体/ライセート混合物に加え、緩やかな攪拌で4°Cで1時間インキュベートします。 チューブを氷の上の磁気スタンドに1分間、またはビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になるまで置きます。ウェスタンブロット分析用に上清を保存します(オプション)。 450 μL の洗浄バッファー (30 mM HEPES, pH = 7.4, 100 mM 塩化カリウム, 0.1% トリトン X, 2 mM 塩化マグネシウム, 10% グリセロール, 1 mM DTT; 表 1)氷上で免疫沈降3x を含むビーズを洗浄します。注:より厳しい洗浄条件が好ましい場合は、追加の洗浄が行われることがあります。 2x SDS/BMEタンパク質ゲルローディングバッファー( 材料表を参照)の20 μLでビーズペレットを再懸濁し、SDS-PAGEゲルにロードする前に95 °Cで5分間沸騰して変性します。あるいは、変性したサンプルは、数ヶ月間-20°Cで保存することができる。注:ビーズ免疫沈降物の一部は、必要に応じて下流RNAの分離のために保存することができます。 4. IPサンプルのウェスタンブロット検出 IP サンプルを SDS-PAGE ゲルにロードします ( 資料表を参照)。サンプルの吸引前に1分間、IPチューブを磁気スタンドに置くことによってビーズを移すことを避けてください。 ウェスタンブロッティング15,16および抗体染色16を次の変更で行います: ALG-1 抗体17 1:500 を 5% 非脂肪乾燥乳 (NFDM) で希釈します。HRPK-1抗体2を5%NFDMで希釈する。5%NFDMでAIN-1抗体18 1:10,000を希釈する。二次抗体(材料表を参照)は、メーカーの指示に従って使用されました。 HRP ベースの化学発光でバンドを検出します ( 材料表を参照)。