Préparation et co-immunoprécipitation d’extrait de protéine de Caenorhabditis elegans
Summary
Cette méthode décrit un protocole pour la préparation d’extrait de protéine à haut débit des échantillons d’elegans de Caenorhabditis et la co-immunoprécipitation suivante.
Abstract
Les méthodes de co-immunoprécipitation sont fréquemment utilisées pour étudier les interactions protéine-protéine. La confirmation d’interactions protéinées-protéines supposées ou l’identification de nouvelles interactions peuvent fournir des informations précieuses sur la fonction d’une protéine d’intérêt. Certaines des méthodes traditionnelles pour la préparation d’extrait exigent fréquemment des techniques laborieurs et chronophages. Ici, un protocole modifié de préparation d’extrait utilisant un homogénéisateur de moulin de perle et des perles en métal est décrit comme alternative rapide aux méthodes traditionnelles de préparation de protéine. Cette méthode de préparation d’extrait est compatible avec des études en aval de co-immunoprécipitation. À titre d’exemple, la méthode a été utilisée pour co-immunoprécipifier avec succès C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 et deux interacteurs connus d’ALG-1 : AIN-1, et HRPK-1. Ce protocole inclut des descriptions de la collecte d’échantillon d’animal, de la préparation d’extrait, de la clarification d’extrait, et de l’immunoprécipice de protéine. Le protocole décrit peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus en endogènes ou surexprimées dans une variété de milieux génétiques.
Introduction
L’identification des interactions macromoléculaires d’une protéine d’intérêt peut être essentielle pour en apprendre davantage sur sa fonction. Des expériences d’immunoprécipitation et de co-immunoprécipitation peuvent être utilisées pour identifier l’interaction entière d’une protéine par des approches protéomiquesà grande échelle 1 ou pour tester spécifiquement la capacité d’une protéine à coprécipifier avec un interacteur hypothéqué. Dans C. elegans, les deux méthodes ont été utilisées avec succès pour en apprendre davantage sur l’activité d’une variété de protéines, y compris celles qui fonctionnent étroitement avec les microARN pour réguler l’expressiondes gènes 2,3,4. Les expériences de co-immunoprécipitation ont l’avantage de tester les interactions protéine-protéine dans leur environnement cellulaire natal, mais la préparation des extraits peut être difficile et prendre beaucoup de temps. Une lyse efficace de l’échantillon est nécessaire, mais il faut prendre soin de minimiser la perturbation des interactions protéines-protéines. Des méthodes telles que le douncing5, la sonication6, l’homogénéisation de Balch7, et la zirconia perles-homogénéisation8,9 ontété employées pour préparer avec succès des extraits totaux de protéine de C. elegans. Ces méthodes, à l’exception de l’homogénéisation des perles de zirconia, ont des limites en termes de nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément. Présentée est une méthode alternative qui peut être facilement mise à l’échelle pour permettre une préparation rapide et à haut débit d’extrait de protéine à partir d’échantillons de C. elegans suivis de co-immunoprécipice. Plus précisément, la méthode peut préparer jusqu’à 24 échantillons à la fois, réduisant considérablement le temps nécessaire à la préparation de l’extrait. En revanche, par exemple, le douncing ne permet généralement qu’une seule préparation d’échantillon à la fois. Cette méthode d’extrait peut être utilisée pour préparer des extraits de n’importe quel stade de développement de C. elegans.
Décrit est une procédure étape par étape pour la collecte d’échantillons d’animaux, la préparation d’extraits, l’immunoprécipitation et la présentation de données de ballonnement occidental pour confirmer le retrait réussi des protéines et la détection de la protéine co-immunoprécipitante d’intérêt. Pour démontrer l’efficacité du protocole, deux expériences de co-immunoprécipitation ont été exécutées entre 1) microARN Argonaute ALG-1 et AIN-1, un homolog GW182 ; et 2) ALG-1 et HRPK-1, un nouvel interacteur ALG-12. ALG-1 et AIN-1 sont des protéines de base qui composent le complexe de silencing induit par microARN (miRISC) et l’interaction entre ces deux protéines estbien établie 10,11. Le protocole de préparation d’extrait était efficace dans l’expérience de co-immunoprécipation d’ALG-1-AIN-1. Ce protocole a également confirmé avec succès l’interaction entre ALG-1 et son nouvel interacteur, HRPK-12.
En résumé, le manuscrit décrit un protocole de préparation d’extrait de C. elegans qui peut être mis à l’échelle jusqu’à traiter simultanément 24 échantillons avec un protocole de co-immunoprécipitation qui peut être utilisé pour identifier de nouvelles interactions ou confirmer des interactions supposées entre les protéines. Le protocole de préparation de l’extrait est compatible avec un certain nombre d’expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et les retraits de microARN12. En outre, le protocole d’immunoprécipitation peut être adapté pour tester les interactions entre deux protéines C. elegans endogènes ou plus endogènes dans une variété de milieux génétiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans est un excellent modèle pour étudier les questions fondamentales en biologie cellulaire, moléculaire et développementale19. En plus de sa puissance en tant que système de modèle génétique, C. elegans est sensible aux approches biochimiques, y compris, mais sans s’y limiter, l’immunoprécipitation et la co-immunoprécipitation des protéines. Un obstacle potentiel lors de la conduite d’expériences d’immunoprécipice est le manque d’anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt. Si aucun anticorps n’est disponible, des anticorps polyclonals ou monoclonaux personnalisés peuvent être générés. Cependant, les innovations récentes dans la technologie d’édition du génome ont permis aux chercheurs d’introduire rapidement des mutations ou tag endogènes gènes C. elegans 20,21, facilitant les études qui démêler les interactions génétiques, fonctionnelles et physiques entre les gènes et les protéines codées. Plus précisément, le marquage crispr/cas9-24 des gènes de C. elegans au loci endogène a réduit la dépendance des expériences d’immunoprécipitation sur la disponibilité d’anticorps, rendant des expériences de co-immunoprécipitation beaucoup plus réalisables. Les gènes C. elegans peuvent être marqués avec une variété d’étiquettes allant des étiquettes fluorescentes telles que GFP ou mCherry aux petites étiquettes telles que FLAG et HA. Les anticorps reconnaissant ces étiquettes sont facilement disponibles dans le commerce, facilitant les études des interactions protéine-protéine par des approches d’immunoprécipitation.
Le protocole présenté, décrit à la figure 1,peut être effectué pour un petit nombre d’échantillons ou mis à l’échelle, ce qui permet jusqu’à 24 préparations d’échantillons à la fois. Bien que les caractérisations initiales des interactions protéine-protéine par immunoprécipitation se font généralement dans des milieux de type sauvage dans des conditions de croissance normales, les études de suivi nécessitent fréquemment de tester les interactions protéine-protéine dans une variété de milieux génétiques ou dans des conditions de croissance différentes. La capacité de préparer simultanément plusieurs extraits permet de gagner du temps et, surtout, assure la cohérence de la préparation des extraits entre les différents échantillons. Un contrôle négatif est toujours nécessaire, le contrôle idéal étant une mutation nulle dans l’encodage génétique de la protéine d’intérêt immunoprécipitée (voir la figure 3 et la figure 4 par exemple).
Ce protocole d’extrait permet la préparation rapide d’extrait de protéine des échantillons de C. elegans et est comparable à l’homogénéisation à base de perle de zirconium8. L’homogénéisation des perles en général peut être réduite à plusieurs préparations simultanées d’échantillons à l’aide d’une variété d’homogénéisateurs de moulin à perles ou d’équipements similaires. Certains homogénéisants plus économiques moulin à perles peuvent réduire le nombre d’échantillons qui peuvent être traités simultanément, cependant. Alternativement, le protocole d’extrait présenté est compatible avec la préparation à base de dounce d’extrait, qui représente une alternative économique. Bien que différents homogénéisants de moulin à perles n’aient pas été testés, la plupart sont susceptibles d’être compatibles avec ce protocole d’extrait de protéine, tant que la perturbation complète des échantillons de C. elegans est atteinte.
Tel que présenté, ce protocole de préparation d’extrait est compatible avec de multiples expériences en aval, y compris l’immunoprécipitationdes protéines 2 et le retrait du microARN12 et permet la collecte en aval des composants protéiques et arn. Il extrait également efficacement les protéines nucléaires et cytoplasmiques (figure 2, figure 3et figure 4). De même, le protocole d’immunoprécipitation présenté permet l’isolement d’ARN des immunoprécipices protéine-associés. Bien que le protocole d’immunoprécipitation ait été initialement mis au point pour identifier les interacteurs protéiques ALG-1, la méthode peut être adaptée pour tester les interactions entre toutes les protéines d’intérêt. En fait, les conditions d’immunoprécipitation utilisées ont fonctionné également bien pour l’immunoprécipitation de l’ALG-1 (figure 3) et du HRPK-1 (figure 4). Ce protocole est un excellent point de départ pour l’immunopurification des protéines liant l’ARN. Il convient toutefois de noter que certains changements dans la composition tampon peuvent être nécessaires pour d’autres protéines d’intérêt. Les changements peuvent dépendre des propriétés physiques et biochimiques de la protéine d’intérêt et doivent être mis en œuvre au cas par cas.
Une fois que la protéine cible (ici, ALG-1 ou HRPK-1) est immunoprécipitatée, le ballonnement occidental peut être utilisé pour tester le co-immunoprécipice pour des interacteurs spécifiques de protéine.
Alternativement, l’immunoprécipice copurifié peut être soumis à l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier toutes les protéines d’interaction putatives. Les interactions confirmées de co-immunoprécipitation peuvent ensuite être examinées dans une variété de milieux ou de conditions génétiques afin d’identifier la régulation potentielle de l’interaction spécifique. Par exemple, pour déterminer si le hrpk-1 joue un rôle dans l’assemblage ALG-1/AIN-1 miRISC, la coprécipitation ALG-1-AIN-1 a été évaluée à la fois dans un contexte sauvage et en l’absence de HRPK-1 (figure 3). hrpk-1 s’est révélé dispensable pour l’interaction ALG-1/AIN-12 (Figure 3). En outre, la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour générer des mutations ponctuelles ou de suppression de domaine dans les protéines d’intérêt. Le retest de la capacité des mutants générés à coprécipifier avec leurs interacteurs protéiques peut révéler quels domaines ou résidus médiation l’interaction physique. De telles études futures peuvent fournir des informations précieuses sur le mécanisme de la fonction et de la régulation des protéines. Ces approches, combinées à la puissance de la génétique C. elegans, peuvent fournir des informations importantes sur les processus moléculaires fondamentaux qui régissent le développement des animaux et la fonction cellulaire.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été en partie soutenu par Kansas INBRE, P20GM103418 à Li et Zinovyeva et R35GM124828 à Zinovyeva. Nous remercions Min Han d’avoir généreusement partagé l’anticorps anti-AIN-1. Certaines des souches utilisées dans le cadre de ces travaux ont été fournies par le Centre de génétique caenorhabdite (CGC), financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
Riferimenti
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