Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans
Summary
Этот метод описывает протокол для высокопровереного приготовления экстракта белка из образцов Caenorhabditis elegans и последующей ко-иммунопреципиентации.
Abstract
Методы со-иммунопреципиентации часто используются для изучения белково-белковых взаимодействий. Подтверждение гипотетизированных белково-белковых взаимодействий или выявление новых может дать неоценимую информацию о функции белка, представляющий интерес. Некоторые из традиционных методов приготовления экстракта часто требуют трудоемких и трудоемких методов. Здесь модифицированный протокол подготовки экстракта с использованием гомогенизатора бисерной мельницы и металлических бусин описывается как быстрая альтернатива традиционным методам приготовления белка. Этот метод подготовки экстракта совместим с исследованиями совместного иммунопреципиентации ниже по течению. В качестве примера метод был использован для успешного со-иммунопреципита C. elegans микроРНК Argonaute ALG-1 и двух известных взаимодействующих ALG-1: AIN-1 и HRPK-1. Этот протокол включает описание сбора образцов животных, подготовки экстракта, уточнения экстракта и иммунопреципиентации белка. Описанный протокол может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессируемыми белками C. elegans в различных генетических предпосылках.
Introduction
Определение макромолекулярных взаимодействий интересного белка может быть ключом к получению дополнительной информации о его функции. Иммунопреципиентация и эксперименты по со-иммунопреципиетации могут быть использованы для определения всего взаимодействия белка с помощью крупномасштабныхпротеомных подходов 1 или для конкретного тестирования способности белка совоккупляться с гипотетическим взаимодействователем. В C. elegans,оба метода были успешно использованы, чтобы узнать больше о деятельности различных белков, в том числе тех, которые тесно функционируют с микроРНК длярегулирования экспрессиигенов 2,3,4. Эксперименты по со-иммунопреципиентации имеют преимущество тестирования белково-белковых взаимодействий в их родной клеточной среде, но подготовка экстракта может быть сложной и трудоемкой. Необходим эффективныйлиз образца, но необходимо позаботиться о том, чтобы свести к минимуму нарушение белково-белковых взаимодействий. Методы, такие как douncing5, sonication6, Balch гомогенизации7, и циркония бисер-гомогенизации8,9 были использованы для успешного подготовки C. elegans общего белка экстрактов. Эти методы, за исключением гомогенизации бисера zirconia, имеют ограничения с точки зрения количества образцов, которые могут быть обработаны одновременно. Представлен альтернативный метод, который может быть легко масштабируется, чтобы обеспечить высокую пропускную способность, быстрый препарат экстракт белка из образцов C. elegans с последующим со-иммунопреципиетации. В частности, метод может подготовить до 24 образцов одновременно, значительно сократив время, необходимое для подготовки экстракта. В отличие от этого, например, douncing обычно позволяет только один образец подготовки за один раз. Этот метод экстракта может быть использован для подготовки экстрактов из любой стадии развития C. elegans.
Описанный является пошаговая процедура для сбора образцов животных, экстракт подготовки, иммунопреципиентации, а также представление западных blotting данных для подтверждения успешного стягивания белка и обнаружения со-иммунопрециплиатации белка интереса. Для демонстрации эффективности протокола были проведены два эксперимента по со-иммунопреципиентации между 1) микроРНК Argonaute ALG-1 и AIN-1, гомологом GW182; и 2) ALG-1 и HRPK-1, недавно выявленный взаимодействующих ALG-12. ALG-1 и AIN-1 являются основными белками, которые составляют микроРНК-индуцированного глушиния комплекса (miRISC) и взаимодействие между этими двумя белками хорошосоздана 10,11. Протокол подготовки экстракта был эффективен в эксперименте по совместной иммунопреципиентации ALG-1-AIN-1. Этот протокол также успешно подтвердил взаимодействие между ALG-1 и его недавно выявленным взаимодействутелем, HRPK-12.
Таким образом, рукопись описывает протокол подготовки экстракта C. elegans, который может быть расширен до одновременного процесса 24 образцов вместе с протоколом совместного иммунодефицита, который может быть использован для выявления новых или подтверждения гипотетизированных взаимодействий между белками. Протокол подготовки экстракта совместим с рядом экспериментов ниже по течению, включая иммунопреципиентированиебелка 2 и микроРНК стягивания12. Кроме того, протокол иммунопреципиентации может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми двумя или более эндогенными, эндогенно помеченными или переэкспрессированными белками C. elegans в различных генетических предпосылках.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans является отличной моделью для изучения фундаментальных вопросов в клеточной, молекулярной и биологииразвития 19. В дополнение к своей силе в качестве генетической модели системы, C. elegans является подлежен биохимических подходов, в том числе, но не ограничиваясь, белка иммунопреципиентации и ко-иммунопреципиентации. Одним из потенциальных препятствий при проведении иммунопреципиентных экспериментов является отсутствие антител, характерных для белков, представляющих интерес. Если антитела не доступны, пользовательские поликлональные или моноклональные антитела могут быть созданы. Тем не менее, последние инновации в технологии редактирования генома позволили исследователям быстро ввести мутации или тег эндогенных генов C. elegans 20,21, облегчая исследования, которые распутывают генетические, функциональные и физические взаимодействия между генами и закодированными белками. В частности, CRISPR/Cas9-опосредованная пометка генов C. elegans в эндогенных локусах снизила зависимость иммунопреципиентных экспериментов от наличия антител, сделав эксперименты по совместной иммунопреципиентации гораздо более осуществимыми. Гены C. elegans могут быть помечены различными тегами, начиная от флуоресцентных тегов, таких как GFP или mCherry, и до небольших тегов, таких как FLAG и HA. Антитела, распознающие эти метки, легко доступны на коммерческой основе, облегчая изучение белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентных подходов.
Представленный протокол, изложенный на рисунке 1,может быть выполнен для небольшого числа образцов или расширен, что позволяет одновременно готовить до 24 образцов. В то время как первоначальные характеристики белково-белковых взаимодействий с помощью иммунопреципиентации обычно проводятся в условиях дикого типа в нормальных условиях выращивания, последующие исследования часто требуют тестирования белково-белковых взаимодействий в различных генетических фонов или в различных условиях роста. Возможность одновременно готовить несколько экстрактов экономит время и, что важно, обеспечивает согласованность подготовки экстракта между различными образцами. Отрицательный контроль всегда требуется, при этом идеальным элементом управления является нулевая мутация в гене, кодирующей иммунопрециализированный белок, представляющий интерес (см. рисунок 3 и рисунок 4 для примеров).
Этот протокол экстракта позволяет быстро готовить экстракт белка из образцов C. elegans и сравним с гомогенизацией на основе бисераzirconium 8. Гомогенизация бисера в целом может быть увеличена до нескольких одновременных препаратов образца с использованием различных гомогенизаторов бисерной мельницы или аналогичного оборудования. Некоторые более экономичные гомогенизаторы бисерной мельницы могут уменьшить количество образцов, которые могут быть обработаны одновременно, однако. Кроме того, представленный протокол экстракта совместим с подготовкой экстракта на основе dounce, что представляет собой экономичную альтернативу. Хотя различные гомогенизаторы бисерной мельницы не были протестированы, большинство из них, вероятно, будут совместимы с этим протоколом экстракта белка, до тех пор, как полное нарушение образцов C. elegans достигается.
Как представлено, этот протокол подготовки экстракта совместим с несколькими экспериментами вниз по течению, включаяиммунопреципиентность белка 2 и микроРНК выдвижной12 и позволяет вниз по течению сбора белков и РНК компонентов. Он также эффективно извлекает как ядерные, так и цитоплазмическиебелки (рисунок 2, рисунок 3и рисунок 4). Аналогичным образом, представленный протокол иммунопреципиентации позволяет РНК-изоляцию от связанных с белком иммунопреципиетов. В то время как протокол иммунопреципиентации был первоначально разработан для выявления взаимодействующих белков ALG-1, метод может быть адаптирован для проверки взаимодействия между любыми белками, представляющими интерес. В самом деле, иммунопроципиентации условия, используемые работал одинаково хорошо для иммунопреципиентации ALG-1(рисунок 3) и HRPK-1 (Рисунок 4). Этот протокол является отличной отправной точкой для иммунопурификации РНК-связывающих белков. Вместе с тем следует отметить, что для других белков, представляющих интерес, могут потребоваться некоторые изменения в составе буфера. Изменения могут зависеть от физических и биохимических свойств белка интереса и должны осуществляться на каждом конкретном случае.
После того, как целевой белок (здесь, ALG-1 или HRPK-1) иммунопреципилитирован, западные blotting могут быть использованы для тестирования со-иммунопрецивитата для конкретных взаимодействующих белков.
Кроме того, копурифицированный иммунопреципитат может быть подвергнут анализу масс-спектрометрии для выявления всех мяуковых взаимодействующих белков. Подтвержденные взаимодействия совместного иммунопреципиентации могут быть изучены в различных генетических фонов или условий для выявления потенциальной регуляции конкретного взаимодействия. Например, для определения роли hrpk-1 в сборке ALG-1/AIN-1 miRISC, С копреципиентирование ALG-1-AIN-1 оценивалось как в фоновом режиме дикого типа, так и при отсутствии HRPK-1(рисунок 3). было установлено, что hrpk-1 может быть незаменим для взаимодействия ALG-1/AIN-12 (рисунок 3). Кроме того, технология редактирования генома CRISPR/Cas9 может быть использована для генерации мутаций удаления одной точки или домена в интересах белков. Повторное тестирование способности генерируемых мутантов к совоккупетит с их белка взаимодействующих может выявить, какие домены или остатки посредников физического взаимодействия. Такие будущие исследования могут дать бесценную информацию о механизме функции белка и регулирования. Эти подходы, в сочетании с силой генетики C. elegans, могут дать важное представление о фундаментальных молекулярных процессах, которые регулируют развитие животных и клеточной функции.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Канзас ИНБРЕ, P20GM103418 Ли и Зиновьева и R35GM124828 в Зиновьева. Мы благодарим Мин Хана за щедрый обмен антителами против АЙН-1. Некоторые из штаммов, используемых в ходе этой работы были предоставлены Caenorhabditis Генетический центр (CGC), финансируемых NIH Управление по программам научно-исследовательской инфраструктуры (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
Riferimenti
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetica. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetica. 202 (3), 885-901 (2016).
