카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전
Summary
이 방법은 Caenorhabditis elegans 샘플 및 후속 공동 면역 침전에서 고처리량 단백질 추출물 제조를 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
공동 면역 침전 방법은 단백질 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 자주 사용됩니다. 가설 단백질-단백질 상호 작용 또는 새로운 단백질의 식별확인은 관심 있는 단백질의 기능에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 추출 준비를 위한 전통적인 방법 중 일부는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 기술이 자주 필요합니다. 여기서, 비드 밀 균질화제 및 금속 비드를 이용한 변형된 추출물 제제 프로토콜은 전통적인 단백질 제제 방법에 대한 신속한 대안으로 설명된다. 이 추출 준비 방법은 다운스트림 공존침전 연구와 호환됩니다. 예를 들어, 이 방법은 C. 예르간 마이크로RNA 아르고나테 ALG-1 및 알려진 ALG-1 인터액터 인 AIN-1 및 HRPK-1을 성공적으로 공동 면역전성염하는 데 사용되었다. 이 프로토콜에는 동물 샘플 수집, 추출물 제제, 추출물 설명 및 단백질 면역 침전에 대한 설명이 포함됩니다. 설명된 프로토콜은 다양한 유전 적 배경에서 어떤 둘 이상의 내인성, 내인성 태그, 또는 과발현 C. elegans 단백질 사이의 상호 작용을 위해 테스트하도록 적응될 수 있다.
Introduction
관심 있는 단백질의 거시분자 상호 작용을 식별하는 것이 그 기능에 대해 더 많이 배우는 데 핵심이 될 수 있습니다. 면역 침전 및 공동 면역 침전 실험은 대규모 프로테오믹 접근법1을 통해 단백질의 전체 상호 작용을 식별하거나 가설 상호 작용자와 결합하는 단백질의 능력을 구체적으로 테스트하는 데 사용될 수 있습니다. C. elegans에서,두 가지 방법은 유전자 발현2,3,4를조절하기 위해 microRNA와 밀접하게 기능하는 단백질의 다양한 활성에 대해 자세히 알아보기 위해 성공적으로 채택되었다. 공동 면역 침전 실험은 그들의 모국적인 세포 환경에서 단백질 단백질 상호 작용을 시험하는 이점이 있습니다, 그러나 추출 준비는 도전적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 시료의 효율적인 용해가 필요하지만 단백질-단백질 상호 작용의 중단을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. douncing5,초음파6,발치 균질화7,및 지르코니아 구슬 균질화8,9와 같은 방법은 성공적으로 C. elegans 총 단백질 추출물을 준비하는 데 사용되었습니다. 이러한 방법은 지르코니아 비드 균질화를 제외하고 동시에 처리될 수 있는 시료 수에 제한이 있습니다. 제시된 대안방법은 C. elegans 샘플로부터 높은 처리량, 신속한 단백질 추출물 제제를 허용하고 공동 면역 침전을 가능하게 하기 위해 쉽게 확장할 수 있는대안이다. 구체적으로, 이 방법은 한 번에 최대 24개의 샘플을 제조할 수 있으며, 추출 준비에 필요한 시간을 크게 줄일 수 있다. 대조적으로, 예를 들어, douncing은 일반적으로 한 번에 하나의 샘플 준비를 허용합니다. 이 추출 방법은 C. elegans의모든 발달 단계에서 추출물을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.
설명된 것은 동물 샘플 수집, 추출물 제제, 면역 침전, 및 서양 블로팅 데이터의 프리젠테이션을 위한 단계별 절차로서 성공적인 단백질 풀다운 및 관심 있는 단백질의 검출을 확인한다. 프로토콜의 효과를 입증하기 위해, 2개의 공동 면역 침전 실험은 1) microRNA Argonaute ALG-1 및 AIN-1, GW182 상동성론 사이에서 수행되었다; 및 2) ALG-1 및 HRPK-1, 새로 확인된 ALG-1 상호작용기2. ALG-1 및 AIN-1은 마이크로RNA 유도 침묵 복합체(miRISC)를 포함하는 핵심 단백질이며 이들 두 단백질 간의 상호작용은10,11로잘 확립된다. 상기 추출물 제제 프로토콜은 ALG-1-AIN-1 공동 면역침전 실험에서 효과적이었다. 이 프로토콜은 또한 ALG-1과 새로 확인된 상호 작용자 HRPK-1 2 간의 상호 작용을 성공적으로확인했습니다.
요약하자면, 원고는 새로운 것을 식별하거나 단백질 간의 가설 상호 작용을 확인하는 데 사용할 수 있는 공동 면역 강수화 프로토콜과 함께 24개의 샘플을 동시에 처리할 수 있는 C. elegans 추출 준비 프로토콜을 설명합니다. 상기 추출물 제제 프로토콜은 단백질 면역침전2 및 마이크로RNA풀다운(12)을포함하는 다수의 다운스트림 실험과 호환된다. 더욱이, 면역 침전 프로토콜은 다양한 유전적 배경에서 어떤 둘 이상의 내인성, 내인성 태그, 또는 과발현C. elegans 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해 적응될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans는 세포, 분자 및 발달 생물학19에서근본적인 질문을 공부하기위한 훌륭한 모델입니다. 유전 적 모델 시스템으로서의 힘 외에도 C. elegans는 단백질 면역 침전 및 공동 면역 침전을 포함하되 이에 국한되지 않는 생화학적 접근법에 적합합니다. 면역 강수량 실험을 실시할 때 한 가지 잠재적인 장애물은 관심 있는 단백질에 특이적인 항체의 부족입니다. 항체가 없는 경우, 맞춤형 폴리클로날 또는 단일 클론 항체가 생성될 수 있다. 그러나, 게놈 편집 기술의 최근 혁신은 연구원이 유전자와 인코딩된 단백질 사이에서 유전, 기능 적, 물리적 상호 작용을 해명하는 연구 결과를 용이하게 하는 돌연변이 또는 꼬리표 내생 C. elegans 유전자20,21을급속하게 소개하는 것을 허용했습니다. 구체적으로, 내인성 loci에서 C. elegans 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 태깅은 항체 가용성에 대한 면역 침전 실험의 의존도를 감소시켜 공동 면역 침전 실험을 훨씬 더 실현가능하게 만듭니다. C. elegans 유전자는 GFP 또는 mCherry와 같은 형광 태그에서 플래그 및 HA와 같은 작은 태그에 이르기까지 다양한 태그로 태그될 수 있습니다. 이러한 태그를 인식하는 항체는 면역 침전 접근법을 통해 단백질 단백질 상호 작용의 연구를 용이하게, 시판적으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
그림 1에설명된 제시된 프로토콜은 소수의 샘플에 대해 수행되거나 확장하여 한 번에 최대 24개의 샘플 준비를 허용합니다. 면역 침전을 통한 단백질 단백질 상호 작용의 초기 특성은 일반적으로 정상적인 성장 조건하에서 야생 유형 배경에서 수행되지만, 후속 연구는 다양한 유전 적 배경이나 다른 성장 조건 하에서 단백질 단백질 상호 작용을 테스트해야합니다. 여러 추출물을 동시에 준비하는 기능은 시간을 절약하고, 중요한 것은 다른 샘플 들 사이에서 추출 준비 일관성을 보장합니다. 음성 조절은 항상 필요하며, 이상적인 제어는 관심있는 면역 침전 단백질에 대한 유전자 인코딩의 null 돌연변이입니다 (예례로 도 3 및 도 4 참조).
이 추출물 프로토콜은 C. elegans 샘플에서 신속한 단백질 추출물 을 제조할 수 있게 해주며 지르코늄 비드 계균화8과비교할 수 있다. 비드 균질화는 일반적으로 다양한 비드 밀 균질화 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 다중 동시 시료 제제까지 확장될 수 있다. 일부 더 경제적인 비드 밀 균질화는 동시에 처리 될 수있는 샘플의 수를 줄일 수 있습니다, 그러나. 대안적으로, 제시된 추출 프로토콜은 경제적인 대안을 나타내는 음주 계 추출물 준비와 호환된다. 다른 비드 밀 균질화는 테스트되지 않았지만, 대부분은 C. elegans 샘플의 완전한 중단이 달성되는 한,이 단백질 추출물 프로토콜과 호환 될 가능성이 높습니다.
제시된 바와 같이, 본 추출물 제제 프로토콜은 단백질 면역침전2 및 마이크로RNA풀다운(12)을 포함한 여러 다운스트림 실험과 호환되며 단백질과 RNA 성분 모두의 다운스트림 수집을 가능하게 한다. 또한 핵 및 세포질 단백질을 효율적으로 추출합니다(도2, 도 3및 도 4). 유사하게, 제시된 면역침전 프로토콜은 단백질 관련 면역 침전염으로부터 RNA 절연을 허용한다. 면역 침전 프로토콜은 원래 ALG-1 단백질 인터액터를 식별하기 위해 개발되었지만, 이 방법은 관심있는 단백질 간의 상호 작용을 테스트하기 위해 적응될 수 있습니다. 실제로, 사용된 면역침전 조건은 ALG-1(도3)및 HRPK-1(도4)을면역침전시키는 데 동등하게 잘 작용하였다. 이 프로토콜은 RNA 결합 단백질의 면역 정화를 위한 우수한 출발점입니다. 그러나 완충 조성에 있는 몇몇 변경은 관심있는 그밖 단백질을 위해 요구될 수 있다는 것을 주의해야 합니다. 변경은 관심있는 단백질의 물리적 및 생화학적 특성에 따라 달라질 수 있으며 사례별로 구현되어야합니다.
표적 단백질(여기, ALG-1 또는 HRPK-1)이 면역침전이되면, 서양 블로팅은 특정 단백질 인터액터에 대한 공동 면역 전현전을 테스트하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 코퓨화된 면역침전이는 모든 퍼티링 상호작용 단백질을 식별하기 위해 질량 분석 분석을 실시할 수 있다. 확인된 공동 면역 침전 상호 작용은 특정 상호 작용의 잠재적인 조절을 확인하기 위하여 유전 배경 또는 조건의 다양한에서 검토될 수 있습니다. 예를 들어, hrpk-1이 ALG-1/AIN-1 miRISC 어셈블리에서 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해, ALG-1-AIN-1 회두는 야생형 배경과 HRPK-1의 부재 에서 모두 평가하였다(도3). hrpk-1은 ALG-1/AIN-1상호작용2(도 3)에대해 분배할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술은 관심 있는 단백질에서 단일 점 또는 도메인 삭제 돌연변이를 생성하기 위하여 이용될 수 있다. 생성된 돌연변이체가 단백질 인터액터와 결합하는 능력을 재테스트하면 물리적 상호 작용을 중재하는 도메인 또는 잔류물이 드러낼 수 있습니다. 이러한 미래 연구는 단백질 기능 및 조절의 메커니즘에 대 한 귀중 한 정보를 얻을 수 있습니다. C. elegans 유전학의 힘과 결합된 이 접근은, 동물 발달 및 세포 기능을 통제하는 기본적인 분자 프로세스에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 캔자스 INBRE에 의해 지원되었다, P20GM103418 리와 지노비에바와 R35GM124828 지노비에바에. 한민한이 항아인-1 항체를 아낌없이 공유해 주셔서 감사합니다. 이 작업의 과정에서 사용되는 균주 중 일부는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에 의해 투자 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 의해 제공되었다 (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
Riferimenti
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetica. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetica. 202 (3), 885-901 (2016).
