来自卡诺哈布迪炎精英的蛋白质提取制剂制备和共免疫沉淀

1. 蠕虫样本收集 种子混合阶段或同步13蠕虫在 NGM 固体板在所需的温度，并允许蠕虫生长，直到所需的阶段。有关基本的C.elegans生长和维护，请参阅斯蒂埃纳格尔等人和波尔塔德拉里瓦等人14，13。 通过用 M9 缓冲器清洗蠕虫板，在 15 mL 锥形离心管中收集蠕虫。 在室温 （RT） 下在 400 x g 下离心 2 分钟，将蠕虫丸化，然后丢弃超自然物。注：用于提取物制备的蠕虫颗粒大小在 100 μL 和 500 μL 之间。建议进行下游免疫沉淀实验，并推荐300微升的包装蠕虫颗粒，通常产生约4.5毫克的总蛋白质，而500微升颗粒将产生约7.5毫克的总蛋白质。 使用 M9 缓冲区执行额外的 3–5 洗涤（参见 表 1），或直到超自然物不再多云。 使用ddH2O进行最后一次洗涤。 将松散的蠕虫颗粒移动到 1.5 mL 微中枢管，并在 RT 以 400 x g 的速度旋转 2 分钟。丢弃剩余的超自然物，获取包装好的蠕虫颗粒，然后进行提取准备。注：协议可在此处暂停。蠕虫颗粒可立即冻结在液氮中，储存在 -80 °C 或液氮中。请注意，蠕虫颗粒只能解冻一次，不能重新冻结。 2. 提取蠕虫颗粒的制备 注意：提取物准备应在冰上或在4°C下进行。 如果冻结，在冰上解冻蠕虫颗粒。注意：如果在样品采集过程中未获得所需的 300 μL 包装蠕虫颗粒大小，则可以组合多个较小的颗粒，直到存在足够的材料以进一步提取。 添加等量的冰冷2倍裂解缓冲器（60米重， pH = 7.4， 100 mM 氯化钾， 0.1% 三通 X， 4 mM 氯化镁， 10% 甘油， 2 mM DTT 与 RNase 抑制剂， 蛋白酶抑制剂， 和磷酸盐抑制剂; 见 表 1）和涡流或移液器上下混合.将管子向下旋转，以收集管底部的混合物。 将混合物移入含有金属珠子的 1.5 mL RNase 无管中（参见 材料表），并将样品放入珠磨同质化剂（见 材料表）中，共度 4 °C。 确保管盖拧紧，样品在均质器内保持平衡。 以最高速度（设置 12）将样品同质化 4 分钟。 从珠子中取出样品，放入新的 1.5 mL 微中微管中。或者，使用同质化剂提供的磁铁可用于从样品中去除珠子。 在 4 °C 下以 19，000 x g 的速度将提取物旋转 20 分钟，以澄清蛋白质提取物。 将超自然物转移到冰上一个新鲜的 1.5 mL 管中，同时避免在样品顶部形成的白色多云沉淀物的随身行李。超自然人现在是澄清的提取物。注：保存澄清提取物的10μL以确定蛋白质总浓度。 立即使用提取物进行以下实验或将提取物闪冻在液氮中，储存在 -80 °C。注：协议可能会在这里暂停。提取物可在超低温下储存（-80°C冰柜或液氮约6个月）。冷冻提取物可以解冻一次，不能重新冷冻。 使用与洗涤剂兼容的蛋白质浓度检测套件（见材料表）确定提取物的总蛋白质浓度（参见 材料表）。 3. 免疫沉淀 注：提取准备的所有免疫沉淀步骤应在冰上或4°C进行。 建议每次免疫沉淀使用2毫克总蛋白质。然而，已经成功地进行了总蛋白质0.8-1毫克的免疫沉淀。始终使用新鲜或新鲜解冻的蛋白质提取物。下列协议概述从总蛋白质的2毫克或单一免疫沉淀实验进行免疫沉淀。对于多个样本，或者如果使用了不同量的蛋白质提取物，珠子和抗体的数量可能会相应增加或减少。 将蛋白质提取物放在冰上或解冻。样品可用冰冷的1倍裂解缓冲器稀释为10毫克/mL或5毫克/mL（见表1）。 通过倒置来恢复磁珠，并将 50% 珠子悬浮的 150 μL 传输到 1.5 mL 管中。将冰上的珠子磁化1分钟或直到溶液清晰为止。丢弃超自然人。 从磁性支架中取出管子，使用 2 卷（即 300 μL）珠子浆洗 1 倍裂解缓冲器中的珠子。重复洗涤2次，共洗三次。 将珠子重新用150微L的冰冷溶解缓冲器。 将珠浆中的 75 μL 转移到 2 毫克蛋白质提取物中，并在 4 °C 下孵育 1 小时，轻轻搅拌。将剩余的珠子悬架保存在冰上供以后使用。注意：此步骤是为了减少免疫沉淀过程中与珠子结合的非特异性蛋白质。 将带样品的管子放在冰上的磁性支架上1分钟，或直到珠子完全磁化，样品清晰。将超自然人转移到新的 1.5 mL 管中;不要打扰珠子。这是预先清除的蛋白质化解。将 10% 的样本保存在西方污点分析中。 在预先清除的番茄酱中加入 20 μg 的亲和纯化抗体，在 4 °C 下孵育 1 小时，轻轻搅拌。注：用于免疫沉淀的抗体量是特定于抗体和蛋白质的，应经经验确定，以确保目标蛋白的有效免疫沉淀。 将预洗珠悬架（步骤 3.5） 的剩余 75 μL 添加到抗体/lysate 混合物中，在 4 °C 下以温和搅拌孵育 1 小时。 将管子放在冰上的磁性支架上1分钟，或直到珠子完全磁化，样品清晰。保存超自然的西方污点分析（可选）。 在 450 μL 的洗涤缓冲区（30 mM HEPES，pH = 7.4，100 mM 氯化钾、0.1% Triton X、2 mM 氯化镁、10% 甘油、1 mM DTT;见 表 1）中清洗含有免疫沉淀物 3 倍的珠子。注意：如果选择更严格的洗涤条件，可以进行额外的洗涤。 在加载到 SDS-PAGE 凝胶之前，在 95 °C 煮沸 5 分钟之前，将珠子颗粒重新加入 20 μL 的 2x SDS/BME 蛋白凝胶加载缓冲器（参见 材料表），然后去自然。或者，变性样品可以在-20°C下储存数月。注意：如果需要，可以保存一部分珠免疫沉淀剂，用于下游RNA隔离。 4. IP 样品的西方污点检测 将 IP 样本加载到 SDS-PAGE 凝胶上（参见 材料表）。避免转移珠子，在样品吸气前将 IP 管放在磁性支架上 1 分钟。 执行西印15，16和抗体染色16与以下修改：稀释LG-1抗体17 1：500在5%非脂干牛奶（NFDM）：稀释HRPK-1抗体2 1：1，000在5%NFDM中;并在5%NFDM中稀释ANI-1抗体18 1：10，000。根据制造商的说明使用了二次抗体（见材料表）。 检测带有基于 HRP 的化学发光带（参见 材料表）。