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Biologia dello sviluppo

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Published: June 20, 2020
doi:
10.3791/61242
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1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke,National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

O objetivo desta técnica é a visualização ex vivo de redes arteriais pulmonares de camundongos pós-natais e adultos precoces através da inflação pulmonar e injeção de um composto radio-opaco à base de polímero através da artéria pulmonar. Também são discutidas possíveis aplicações para tecidos fundidos.

Abstract

Vasos sanguíneos formam redes intrincadas no espaço tridimensional. Consequentemente, é difícil apreciar visualmente como as redes vasculares interagem e se comportam observando a superfície de um tecido. Este método fornece um meio de visualizar a complexa arquitetura vascular tridimensional do pulmão.

Para isso, um cateter é inserido na artéria pulmonar e a vasculatura é simultaneamente lavada de sangue e quimicamente dilatada para limitar a resistência. Os pulmões são então inflados através da traqueia a uma pressão padrão e o composto de polímero é infundido no leito vascular a uma taxa de fluxo padrão. Uma vez que toda a rede arterial é preenchida e permitida a cura, a vasculatura pulmonar pode ser visualizada diretamente ou visualizada em um scanner micro-CT (μCT).

Quando realizado com sucesso, pode-se apreciar a rede arterial pulmonar em camundongos que variam de idades pós-natal precoces a adultos. Além disso, enquanto demonstrado no leito arterial pulmonar, este método pode ser aplicado em qualquer leito vascular com colocação otimizada de cateter e pontos finais.

Introduction

O foco desta técnica é a visualização da arquitetura arterial pulmonar usando um composto à base de polímero em camundongos. Embora tenha sido realizado um trabalho extensivo em leitos vasculares sistêmicos como cérebro, coração e rim1,2,,3,4,5, há menos informações sobre a preparação e o preenchimento da rede arterial pulmonar. O objetivo deste estudo, portanto, é expandir o trabalho anterior6,,7,8 e fornecer uma referência escrita e visual detalhada que os pesquisadores podem facilmente seguir para produzir imagens de alta resolução da árvore arterial pulmonar.

Enquanto existem inúmeros métodos para rotulagem e vasculatura pulmonar de imagem, como ressonância magnética, ecocardiografia ou angiografia ct9,10, muitas dessas modalidades não conseguem preencher adequadamente e/ou capturar os pequenos vasos, limitando o escopo do que pode ser estudado. Métodos como secção serial e reconstrução fornecem alta resolução, mas são tempo/trabalho intensivo11,,12,13. A integridade do tecido mole circundante está comprometida na fundição tradicional de corrosão10,13,14,15,16. Mesmo a idade e o tamanho dos animais tornam-se fatores ao tentar introduzir um cateter ou, falta resolução. A técnica de injeção de polímero, por outro lado, preenche as artérias ao nível capilar e, quando combinada com μCT, permite uma resolução incomparável5. Amostras de pulmões de camundongos tão jovens quanto o pós-natal 14 foram lançadas com sucesso8 e processadas em questão de horas. Estes podem ser rescandados indefinidamente, ou mesmo enviados para preparação histológica/microscopia eletrônica (EM) sem comprometer o tecido mole existente17. As principais limitações para este método são o custo inicial do equipamento/software ct, desafios com o monitoramento preciso da pressão intravascular e a incapacidade de adquirir dados longitudinalmente no mesmo animal.

Este artigo baseia-se no trabalho existente para otimizar ainda mais a técnica de injeção da artéria pulmonar e empurrar os limites relacionados à idade/tamanho até o pós-natal 1 (P1) para produzir resultados impressionantes. É mais útil para equipes que desejam estudar redes vasculares arteriais. Assim, fornecemos novas orientações para a colocação/estabilização do cateter, maior controle sobre taxa/volume de preenchimento e destacamos armadilhas notáveis para o aumento do sucesso de fundição. Elencos resultantes podem então ser usados para caracterização futura e análise morfológica. Talvez mais importante, esta é a primeira demonstração visual, pelo nosso conhecimento, que orienta o usuário através deste procedimento intrincado.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pulmão e Sangue do Coração. 1. Preparação Injete o mouse intraperitonealmente com heparina (1 unidade/g de peso corporal do rato) e deixe-o ambulatório por 2 minutos. Eutanize o animal em uma câmara de CO2. Disponha o mouse em uma posição supina em uma placa cirúrgica e fixe todos os quatro membros na placa c…

Representative Results

Um elenco bem sucedido exibirá o preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Demonstramos isso em camundongos C57Bl/6J variando em idade: Dia pós-natal P90 (Figura 4A),P30(Figura 4B),P7(Figura 4C)e P1(Figura 4D). Controlando a taxa de fluxo e monitorando visualmente o preenchimento em tempo real, foram alcançados pontos finais confiáveis da vasculatura m…

Discussion

Executado corretamente, este método produz imagens marcantes de redes arteriais pulmonares, permitindo comparação e experimentação em modelos de roedores. Vários passos críticos ao longo do caminho garantem o sucesso. Primeiro, os investigadores devem heparinizar o animal na fase preparatória para evitar que coágulos sanguíneos se formem na vasculatura pulmonar e câmaras do coração. Isso permite o trânsito arterial completo do composto polímero. Em segundo lugar, ao perfurar o diafragma e remover a caixa t…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramuros da NHLBI (DIR HL-006247). Gostaríamos de agradecer ao NIH Mouse Imaging Facility por orientação em aquisição e análise de imagens.

Materials

1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma – Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system SkyScan  1172
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B – MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).
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