Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen
Summary
Ein Protokoll zur Blockierung des Lymphflusses durch chirurgische Saat ierung von afferent lymphatischen Gefäßen wird vorgestellt.
Abstract
Lymphgefäße sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Gewebeflüssigkeit und die Optimierung des Immunschutzes durch den Transport von Antigenen, Zytokinen und Zellen zu entwässernden Lymphknoten (LNs). Unterbrechung des Lymphflusses ist eine wichtige Methode bei der Untersuchung der Funktion von Lymphgefäßen. Die affeken Lymphgefäße vom murinen Fußpolster bis zu den poplitealen Lymphknoten (pLNs) sind als die einzigen Wege für die Lymphdrainage in die pLNs klar definiert. Das Abtinnen dieser affemenden Lymphgefäße kann selektiv den Lymphfluss zu den pLNs verhindern. Diese Methode ermöglicht Störungen des Lymphflusses mit minimalen Schäden an den lymphatischen Endothelzellen in den entwässernden pLN, den affepfen den Lymphgefäßen sowie anderen Lymphgefäßen in der Umgebung. Diese Methode wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Lymphe hohe endotheliale Venule (HEV) und Chemokinexpression in der LN beeinflusst und wie Lymphe durch das Fettgewebe fließt, das die LN umgibt, wenn es keine funktionellen Lymphgefäße gibt. Mit der zunehmenden Anerkennung der Bedeutung der lymphatischen Funktion wird diese Methode breitere Anwendungen haben, um die Funktion von Lymphgefäßen bei der Regulierung der LN-Mikroumgebung und der Immunantworten weiter zu entwirren.
Introduction
Die räumliche Organisation des Lymphsystems bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, um extrazelluläre Flüssigkeit effizient zu entfernen und Antigene und Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu den entwässernden LNs zu transportieren. Die ersten lymphatischen Gefäße (auch Lymphkapillaren genannt) sind aufgrund ihrer diskontinuierlichen interzellulären Verbindungen, die die effektive Sammlung von Flüssigkeiten, Zellen und anderen Materialien aus den umliegenden extrazellulärenRäumen1 erleichtern, sehr durchlässig. Die ersten lymphatischen Gefäße verschmelzen zu sammelnden Lymphgefäßen, die enge interzelluläre Verbindungen, eine kontinuierliche Kellermembran und lymphatische Muskelabdeckung haben. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist verantwortlich für den Transport der gesammelten Lymphe zu den entwässernden LNs und schließlich die Rückkehr der Lymphe in den Kreislauf2,3. Die sammelnden Lymphgefäße, die Lymphe in die entwässernden LN treiben, sind die afferent lymphatischen Gefäße4,5,6,7. Die Behinderung der affektiven Lymphgefäße kann den Lymphfluss in die LNs blockieren, was eine nützliche Technik bei der Untersuchung der Funktion des Lymphflusses ist.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Lymphfluss eine wichtige Rolle beim Transport von Antigenen und APCs spielt, sowie bei der Aufrechterhaltung der LN-Homöostase. Es ist allgemein bekannt, dass gewebeabgeleitete APCs, typischerweise aktivierte migrierende dendritische Zellen (DCs), durch die affemenden Lymphgefäße zu den LN reisen, um T-Zellen zu aktivieren8. Die Idee, dass Freiform-Antigene, wie Mikroben oder lösliche Antigene, passiv mit Lymphe zu den LN fließen, um LN-residente APCs zu aktivieren, hat sich in den letzten zehn Jahrendurchgesetzt 9,10,11,12. Freiform-Antigene, die mit Lymphe reisen, dauern Minuten nach der Infektion, um zu den LN zu gelangen, und die LN-Resident-Zellaktivierung kann innerhalb von 20 min nach der Stimulation auftreten. Dies ist viel schneller als die Aktivierung von migrierenden DCs, die mehr als 8 h benötigt, um in die entwässernde LN9einzusteigen. Neben dem Transport von Antigenen zur Einleitung des Immunschutzes trägt die Lymphe auch Zytokine und DCs zu den LN, um ihre Mikroumgebung zu erhalten und die Immunzellhomöostase13,14zu unterstützen. Zuvor zeigte die Blockierung des Lymphflusses durch Das Aifaktum der affepfenden Lymphgefäße, dass Lymphe erforderlich ist, um den HEV-Phänotyp aufrechtzuerhalten, der zur Unterstützung der homöostatischen T-Zelle und der B-Zelle erforderlich ist, die bis zum LN15,16,17. CCL21 ist ein kritisches Chemokin, das die Dc- und T-Zellenpositionierung im LN8,18leitet. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die CCL21-Expression im LN und unterbricht möglicherweise die Positionierung und/oder Interaktion von DC- und T-Zellen im LN19. So kann die Blockierung des Lymphflusses den Antigen-/DC-Zugang zu den entwässernden LN direkt oder indirekt abschaffen, indem die LN-Mikroumgebung gestört wird, die die Immunantworten in der LN reguliert. Um die Funktion des Lymphflusses besser untersuchen zu können, wird ein experimentelles Protokoll vorgestellt (Abbildung 1), um den Lymphfluss bei Mäusen zu blockieren, indem die affemenden Lymphgefäße vom Fußpad zum pLN durchnäht werden. Diese Methode kann eine wichtige Technik für zukünftige Studien über die lymphatische Funktion bei gesunden und kranken Bedingungen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Blockierung des Lymphflusses wird breite Anwendungen bei der Manipulation der Antigenabgabe an die LN unter gesunden und kranken Bedingungen haben. Es ist möglich, diese Methode zu verwenden, um den Zeitpunkt der Antigenabgabe zu kontrollieren, um zu untersuchen, wie der kontinuierliche Lymphfluss die Immunantwort bei entleerenden LNs reguliert. Diese Methode der Lymphflussunterbrechung kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Lymphauswirkungen Zellkompartalisation, Zellaktivierung, Zellmigration und Zell-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Ava Zardynezhad für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird vom Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) und der Canada Foundation for Innovation for SL (32930) und der National Natural Science Foundation of China für Yujia Lin (81901576) unterstützt.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
Riferimenti
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
