ショウジョウバエ・メラノガスターの概日伝播

1. フライ食品生産 水の1 Lごとに、乾燥糖蜜の4.69 g、乾燥活性酵母の19.70 g、トウモロコシの食事の87.22 gと寒天の7.83グラムからなるフライ食品を調製します。 上記の内容物をクロックポットに組み合わせ、熱を250°Fに変えます。 材料と同様に混ぜる。 フライフードが加熱されている間、蓋をクロックポットに置き、10分ごとに内容物を混ぜ合わせて、転がれ沸騰するまで蓋をします。沸騰したゆを20分間続けてから火を消します。 83.60mLの水を加え、食べ物が冷やすようにクロックポットの蓋を外します。 ガラス温度計で10分ごとに食品の温度を混ぜて記録します。食べ物の上にフィルムの層を落ち着かせないようにしてください。 食品が60°Cに冷却されたら、テゴセプトの10.44 mLと加水1リットル当たりプロピオン酸5.51mLを加えます(ステップ1.1を参照)。 よく混ぜて60°Cまで加熱し、食品が冷えすぎないようにします。 ドロソフィラーを使用して、必要に応じてフライフードをポンプで送ります。 狭いバイアルの場合、ポンプ10 mLと6オンスの正方形の底のボトルポンプ60 mL。 2. 指定された年齢のハエの収集 野生型ハエのモニターボトルは、25°Cで5〜7日間保存され、大量の子犬(約200個の子犬)がボトルの側面に取り付けられるまで保管されています。使用されるボトルは、正方形の底を持つ6オンスショウジョウバエストックボトルです。 ボトルから既存の大人をクリアします。大人を新しいボトルに入れるか、70%エタノールに入れます。#0の絵筆の鈍い端を使用して、残りの大人をフライフードに押し込みます。使用前と使用後に70%エタノールでペイントブラシを拭き取るようにしてください。 クリアしたボトルを25°Cのインキュベーターで3日間座って、次世代が閉じられるようにします。これらのハエは0〜3日の間になります。 3. フライの分離 3日後、男性を女性から分離し、4つのタイムポイントごとに性別ごとに所望の数を集める。ハエは生殖器を調べることによってセックスによって区別することができる。男性は暗い丸みを帯びた生殖器を持っているのに対し、女性は明るく、より尖った生殖器を持っている。メスもオスのハエよりはるかに大きい。 CO2麻酔2パッドを使用して、ハエを効果的に分離し、男女を区別します。ハエを殺さないように、ペイントブラシで動かしてください。 各タイムポイントに対して100人の男性と100人の女性を集め、バイアルあたり50人の男性とバイアルあたり100人の女性を集める。男性はより積極的になる傾向があり、彼らの社会的相互作用は、バイアルに100人の個人がいるときに多くの死につながります。バイアルに含まれている間、最大100人の女性は影響を受けません。 ZT1、ZT7、ZT13、ZT19 (表 1) の時点でコレクションを実行します。暗い(ZT12-ZT24)で行われたコレクションは光に敏感であるのに対し、ZT0-ZT11コレクションはライトオン時に行われ、ルームライトは点灯することができます。2つの別々のインキュベーターは、すべてのコレクションが一晩ではなく日中に発生することを可能にするために、逆12時間の光パターンで使用されることに注意してください。 余分なハエを使用して、将来のエントレインメントのためにハエの新しいボトルを作成します。新しいボトルに5〜7人の男性を入れた25人のメスを入れ、25°Cの保育器に入れます。 4. フライインキュベーション 概日の巻き込みが発生できるように、ハエが3〜5日間光規制インキュベーターに滞在することを許可します。少量の光害でも封じ込めが妨げになるので、インキュベーターが軽く締まるようにしてください。 5. 免疫蛍光固定 エントレーニング後、免疫蛍光に使用されるサンプルの固定溶液の新しいバイアルを準備します。インキュベーターからハエを取り除く前に、固定される100ハエごとに新しい狭いバイアルに1x PBS + 0.1%Tween-20で希釈した4%ホルムアルデヒドの4.8 mLを加えます。各バイアルは、100人の男性または100人の女性の概日訓練されたハエを収容します。細いバイアルを氷の中に入れる。 6. 免疫蛍光コレクション 蛍光免疫のためにインキュベーターからハエを採取する場合は、ボトルキャップを取り外し、ボトルを漏斗に素早く反転します。ハエを漏斗で溶液にそっとタップして、ハエをバイアルに導きます。1つのバイアルに合計100人の男性のための50の男性の2つのチューブを組み合わせ、他のバイアルのための100の女性の単一のチューブを使用しています。 暗闇の中でZT13とZT19コレクションを実行します。ショウジョウバエがこれらの光波長に対する感受性がはるかに低く、したがって光汚染13になりやすいので見るために赤い光を使用してください。特にクリプトクロムタンパク質は青色光に対して特に感受性であり、14を避けなければならない。 光の露出を減らすために、コレクションの部屋が遮られたり覆われた光の源で軽く締まるようにしなさい。次の手順で、ZT13およびZT19ハエがナットミキサーに置かれたときに光にさらされないように、これらのバイアルをホイルで包みます。ZT1およびZT7ハエは光に敏感ではなく、ホイルカバーなしでミキサーに置くことができる。 7. ミキサーとストレージの栄養を取り込む ハエが回収された後、こぼれを避けるために固定剤を含むバイアルの上部をテープで貼り付け、4°Cで165 RPMの栄養ミキサーに4時間置きます。この固定ステップの後、ハエはもはや光に敏感ではないので、溶液が動いていることを確認するためにホイルを取り除き、ハエが固定剤に沈められていることを確認することができます。 ヌテッティングミキサーからバイアルを含むハエを取り除いた後、ホルムアルデヒドを取り出し、3,000 μLの1x PBSで3回洗浄し、洗浄ごとにバイアルを反転します。 免疫蛍光サンプルを持つバイアルを4°Cに保存して、将来の免疫蛍光15を待つ。 8. タンパク質抽出用コレクション タンパク質抽出用サンプルを保存するために、4本の50 mLチューブと液体窒素を含むデュワーを用意 タンパク質または核酸抽出のためにハエを収集するために、ステップ6.1と同じ方法でボトルからチューブにハエを移し、すぐにチューブをキャップしてハエの放出を防ぎ、チューブを液体窒素に入れて凍結します。 9. タンパク質抽出用ストレージ タンパク質抽出用のスナップ凍結サンプルを-80 °Cに保存します。 これらは、下流分析に適したタンパク質抽出プロトコルに従って処理することができる、免疫ブロット16を含む。