Formation circadienne de Drosophila Melanogaster

1. Production alimentaire à la mouche Par 1 L d’eau, préparer des aliments à la mouche composé de 4,69 g de mélasse séchée, 19,70 g de levure active sèche, 87,22 g de farine de maïs et 7,83 g d’agar. Mélanger le contenu indiqué ci-dessus dans une marmite et tourner la chaleur à 250 °F. Bien mélanger et ajouter les ingrédients. Gardez le couvercle sur la marmite pendant que la nourriture à mouche chauffe tout en mélangeant le contenu toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’il atteigne une ébullition de roulement. Laisser l’ébullition de roulement se poursuivre pendant 20 min avant d’éteindre le feu. Ajouter 83,60 mL d’eau et garder le couvercle de la marmite au loin pendant que les aliments refroidissent. Mélanger et enregistrer la température des aliments toutes les 10 minutes à l’aide d’un thermomètre en verre. Évitez de laisser une couche de film s’installer sur la nourriture. Une fois que les aliments ont refroidi à 60 °C, ajouter 10,44 mL de Tegosept et 5,51 mL d’acide propionique par litre d’eau ajoutée (voir étape 1.1). Bien mélanger et faire chauffer jusqu’à 60 °C pour éviter que les aliments ne deviennent trop frais. Pomper la nourriture mouche au besoin à l’aide de la Droso-remplissage. Pour les flacons étroits, pompez 10 ml et pour 6 oz bouteilles de fond carré pompe 60 ml. 2. Collecte des mouches d’âge défini Surveiller les bouteilles de mouches de type sauvage stockées à 25 °C pendant 5-7 jours jusqu’à ce que de grandes quantités de pupe (environ 200 pupes) soient fixées sur le côté de la bouteille. Les bouteilles utilisées sont 6 oz bouteilles de stock Drosophila avec des fonds carrés. Dégagez les adultes existants de la bouteille. Soit faire basculer les adultes dans une nouvelle bouteille ou les placer dans 70% d’éthanol. Utilisez l’extrémité terne d’un pinceau #0 pour pousser les adultes restants dans la nourriture à la mouche. Assurez-vous d’essuyer le pinceau avec 70% d’éthanol avant et après les utilisations. Laisser les bouteilles déblayées s’asseoir pendant 3 jours dans un incubateur de 25 °C pour permettre à la prochaine génération d’effacer. Ces mouches auront entre 0 et 3 jours. 3. Séparation des mouches Après 3 jours, séparer les mâles des femelles et recueillir le nombre souhaité pour chaque sexe pour chacun des quatre points de temps. Les mouches peuvent être différenciées par le sexe en examinant les organes génitaux; les mâles ont des organes génitaux arrondis foncés tandis que les femelles ont des organes génitaux plus légers et plus pointus. Les femelles sont également beaucoup plus grandes que les mouches mâles. Utilisez un tampon d’anesthésie CO2 pour séparer efficacement les mouches et différencier entre les sexes. Déplacez les mouches avec des pinceaux pour éviter de les tuer. Recueillir 100 mâles et 100 femelles pour chaque point de temps, avec 50 mâles par flacon et 100 femelles par flacon. Les hommes ont tendance à être plus agressifs et leurs interactions sociales entraînent beaucoup de décès lorsqu’il y a 100 personnes dans une fiole. Les femelles – jusqu’à 100 individus – ne sont pas affectées lorsqu’elles sont contenues dans la fiole. Effectuer les collections aux points d’heure suivants : ZT1, ZT7, ZT13 et ZT19 (Tableau 1). Notez que les collections réalisées dans l’obscurité (ZT12-ZT24) sont sensibles à la lumière tandis que les collections ZT0-ZT11 sont effectuées pendant les heures d’éclairage et les lumières de la pièce peuvent être allumées. Veuillez noter que deux incubateurs distincts sont utilisés avec des motifs de lumière inverses de 12 heures pour permettre à toutes les collections de se produire pendant la journée et non pendant la nuit. Utilisez des mouches excédentaires pour créer de nouvelles bouteilles de mouches pour l’entraînement futur. Placer 25 femelles avec 5 à 7 mâles dans chaque nouvelle bouteille et placer dans l’incubateur à 25 °C. 4. Incubation de mouches Laissez les mouches rester dans des incubateurs réglementés par la lumière pendant 3-5 jours pour permettre à l’entraînement circadienne de se produire. Assurez-vous que les incubateurs sont étanches à la lumière, car même de petites quantités de pollution lumineuse perturberont l’entraînement. 5. Fixation de l’immunofluorescence Après l’entraînement, préparez de nouveaux flacons de solution de fixation pour les échantillons qui seront utilisés pour l’immunofluorescence. Avant d’enlever les mouches de l’incubateur, ajouter 4,8 mL de 4% de formaldéhyde dilué en 1x PBS + 0,1% Tween-20 à chaque nouveau flacon étroit pour chaque 100 mouches qui doivent être fixés. Chaque flacon abritera 100 mâles ou 100 mouches circadiennes femelles. Placez les flacons étroits dans la glace. 6. Collecte d’immunofluorescence Lors de la collecte des mouches de l’incubateur pour l’immunofluorescence, retirer le bouchon de la bouteille et inverser rapidement la bouteille dans l’entonnoir. Appuyez doucement sur les mouches dans la solution par l’intermédiaire de l’entonnoir pour aider à guider les mouches dans le flacon; combiner deux tubes des 50 mâles pour un total de 100 mâles dans un flacon et utiliser un seul tube de 100 femelles pour l’autre flacon. Exécutez les collections ZT13 et ZT19 dans l’obscurité; utiliser une lumière rouge afin de voir que la drosophila sont beaucoup moins sensibles à ces longueurs d’onde lumineuses et sont donc moins sujettes à la pollution lumineuse13. La protéine cryptochrome, en particulier, est particulièrement sensible à la lumière bleue, qui doit être évitée14. Pour réduire l’exposition à la lumière, assurez-vous que la pièce de collecte est étanche à la lumière, toutes les sources de lumière étant bloquées ou couvertes. Enveloppez ces flacons dans du papier d’aluminium de sorte que les mouches ZT13 et ZT19 ne soient pas exposées à la lumière lorsqu’elles sont placées sur le mélangeur à noix à l’étape suivante. Les mouches ZT1 et ZT7 ne sont pas sensibles à la lumière et peuvent être placées sur le mélangeur sans revêtement de papier d’aluminium. 7. Mélangeur et rangement à la noix Une fois les mouches recueillies, collez le dessus des flacons contenant des produits fixatifs pour éviter les déversements et placez-les sur le mélangeur à 165 tr/min à 4 °C pendant 4 h. Les mouches ne sont plus sensibles à la lumière après cette étape de fixation, de sorte que le papier d’aluminium peut être enlevé pour vérifier que la solution se déplace et les mouches sont submergées dans le fixatif. Après avoir enlevé la mouche contenant des flacons du mélangeur à noix retirer le formaldéhyde et laver trois fois avec 3.000 μL de 1x PBS, inverser le flacon à chaque lavage. Stockez les flacons portant des échantillons d’immunofluorescence à 4 °C en attendant l’immunofluorescencefuture 15. 8. Collecte pour l’extraction de protéines Préparer quatre tubes de 50 mL et un Dewar contenant de l’azote liquide pour la conservation d’échantillons destinés à l’extraction de protéines Pour la collecte des mouches pour l’extraction de protéines ou d’acide nucléique, transférer les mouches des bouteilles vers le tube de la même manière qu’à l’étape 6.1 et rapidement plafonner le tube pour empêcher la libération des mouches et placer le tube dans l’azote liquide pour casser le gel. 9. Stockage pour l’extraction de protéines Conserver les échantillons congelés pour l’extraction de protéines à -80 °C. Ceux-ci peuvent être traités selon le protocole d’extraction de protéines approprié pour l’analyse en aval, y compris l’immunoblotting16.