Circadian Entrainment من دروسوفيليا ميلانوغاستر
Summary
هنا، نحن بالتفصيل كيفية مزامنة دروسوفيلا إلى يوم circadian. هذه هي الخطوة الأولى والأهم من ذلك لدراسة الإيقاعات البيولوجية وعلم الكرونوبيولوجيا.
Abstract
تقريبا عالمية بين الكائنات الحية، إيقاعات circadian تنسيق النشاط البيولوجي لمدار الأرض حول الشمس. لتحديد العوامل التي تخلق هذا الإيقاع وفهم المخرجات الناتجة ، مطلوب entrainment من الكائنات الحية النموذجية إلى نقاط زمنية circadian محددة. هنا نحن بالتفصيل إجراء لentrain العديد من Drosophila إلى إيقاع circadian محددة. وعلاوة على ذلك، نحن تفاصيل ما بعد entrainment الخطوات لإعداد عينات من الفلورالين المناعية، وحمض نووي، أو تحليل البروتين القائم على استخراج.
Introduction
تقريبا جميع الكائنات الحية على الأرض، من أكبر وصولا إلى خلية واحدة، لديها ساعة البيولوجية الداخلية مع دورة من حوالي يوم واحد. وهذا يعرف باسم إيقاع Circadian (صاغ في عام 1953 من قبل فرانز هالبرغ من العبارات اللاتينية حوالي = حول / تقريبا و “يموت” = يوم)1. على الرغم من أن مكونات الساعة الأساسية معروفة وآلياتها البدائية للوظيفة مفهومة ، لا يزال هناك الكثير لفهم كيفية الحفاظ على الإيقاعات البيولوجية في جميع أنحاء الجسم. الأهم من ذلك، يرتبط سوء تنظيم الإيقاعات البيولوجية مع النتائج الصحية السيئة بما في ذلك ضعف تكوين الذاكرة، واضطرابات النوم، واضطراب التأثير الموسمي، والاكتئاب، والاضطراب ثنائي القطب، والسكري، والسمنة، والتنكس العصبي، والسرطان2،3،4،5.
دروسيليا هو نموذج راسخ للتحقيق في البيولوجيا circadian. وراثيا وكيميائيا، يتم تدريب أعداد كبيرة بسهولة (كما سيظهر). في الواقع، جميع المنشورات السبعة المذكورة كمطبوعات رئيسية للدعم في منح جائزة نوبل لاكتشاف إيقاعات circadian الاستفادة من هذه القوة من نموذج Drosophila6،7،8،9،10،11،12.
بالإضافة إلى ذلك، نعرض استراتيجيات فعالة لجمع الذباب المُتَجَنَّع لأغراض إما من الفلورا المناعية، أو الحمض النووي، أو التحليل القائم على استخراج البروتين. وباستخدام هذه الاستراتيجيات، يمكن للمرء أن يعالج ويخزن كميات أكبر من العينات لتحليلها في المستقبل. هذه الأساليب مفيدة جداً في أنها قابلة للتكرار ويمكن أن تسفر عن مئات من الذباب entrained التي يمكن أن تكون جزءاً من تجمع بيانات كبيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم الباحثون هذا البروتوكول مع النجاح والاتساق. يسمح هذا الإجراء تثبيت تجمع أخذ العينات كبيرة التي يمكن تخزينها للتحليل في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، تحافظ هذه الاستراتيجية على الأنماط العصبية الناجمة عن entrainment لفحصها في المستقبل.
التثبيت للتخزين هو عنصر رئيسي في عملية entrainment كما أنه يساعد على استقرار أنسجة الدماغ ويسمح لمزيد من الوقت لتحليل كل دماغ من تجمع البيانات وبالتالي تقليل النفايات من الأدمغة التي تفقد القدرة على البقاء بسبب سن21. والهدف الرئيسي هو أن circadian entrain أكبر عدد ممكن من الذباب بحيث يكون هناك مخزون مستمر متاح لتشريح الرأس وفي نهاية المطاف immunofluorescence أو استخراج البروتين لمراقبة النتائج وتحديد ما إذا كانت النتائج هي من الثقة العالية. لضمان الحفاظ على entrainment circadian من خلال التثبيت، فمن جزء لا يتجزأ من أن يتم القضاء على أي مصدر من مصادر التلوث الضوئي. عملية التثبيت يسمح لدروسوروسفيليا ليتم تخزينها مع الحفاظ على العصبية “الطابع الزمني” بحيث يمكن تشريحها في وقت لاحق وتحليلها مع عدم وجود اختلافات ملحوظة للذباب التي يتم تشريحها وخضعت للflufluorescence مباشرة بعد entrainment. لأغراض التثبيت قبل الفلورة المناعية، حدد المختبر باتساق أن الذباب قابل للحياة على الأقل لمدة شهر واحد. تثبيت لاستخراج البروتين البقع الغربية تجعل الأدمغة قابلة للحياة إلى أجل غير مسمى عند تخزينها في -80 درجة مئوية.
آخر خطوة بروتوكول حاسم هو جنس الذباب. من المهم أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بدقة حيث أن وجود كلا الجنسين في نفس القارورة قبل التثبيت يمكن أن يؤدي إلى التزاوج ، مما سيؤدي إلى ذباب جديد من عمر أصغر وفساد تحليل البروتين إذا تم فحص الذكور بطريق الخطأ بدلاً من الإناث أو العكس. بالإضافة إلى ذلك ، عند ممارسة الجنس من المهم إزالة عينات اليرقات التي يتم ربطها في بعض الأحيان بالإناث. وهذا يمنع تطوير ذرية جديدة داخل قارورة الإناث التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج فاسدة.
قد تكون الخطوة التالية لبروتوكول entrainment مع العناصر المتعلقة بتحليل البيانات. يركز البروتوكول على توطين البروتين ، ولكن إذا كانت هناك متغيرات أخرى تتأثر بـ entrainment circadian ، فيجب استكشافها من خلال طرق جديدة ، تتطلب غالبًا استخراج البروتين أو الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، هناك بروتينات أخرى من الدماغ التي قد لا تزال يمكن تحليلها عن طريق هذا البروتوكول. وقد حللت التجارب المرتبطة بالبروتوكول بعض البروتينات ولكن قائمة الجينات والبروتينات التي تلعب دورا في البيولوجيا الإيقاعية لم تستنفد بعد. البروتوكول فعال في تحقيق هدف إنشاء إيقاع circadian ، ومع ذلك ، فإن التطبيقات واسعة النطاق.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص لجامعة ميسوري كانساس سيتي ومختبر جيفري ل. برايس.
Materials
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
Riferimenti
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S. Neurodegeneration and the Circadian Clock. Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170 (2017).
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science’s signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
