Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi
Summary
Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.
Abstract
Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC’ ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir. Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC’lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5’e yanıt olarak P-SSC’lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.
Introduction
Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki yeni farklılaşan kıkırdak aralarına ve osteoblastlara katkıda bulunur ve periosteum içinde belirgin bir iskelet sapı / progenitör hücre popülasyonunun varlığını bu işe bular. Bu nedenle periosteumda yerleşik iskelet kök hücrelerinin (SSC) tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu dejeneratif kemik hastalıkları ve kemik defektleri için umut verici bir terapötik yaklaşım oluşturmaktadır4.
SSC’lerin kemik iliği de dahil olmak üzere birden fazla doku bölgesinde bulunduğu düşünülmektedir. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6’da osteojenik/kondrojenik SSC’ler de tanımlanmıştır. Bu periosteal SSC’ler (P-SSC’ler) fetal kemik gelişimi sırasında erken mezenkimal soy belirteçleri (örneğin Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 ve Axin2-CreER8) ile etiketlenebilir4,7,8,9,10. Bu tek genetik soy izleme modellerinin önemli bir sınırlaması, etiketli hücre popülasyonlarında önemli bir heterojenlik olmasıdır. Ayrıca, etiketli SSC’leri progeny in vivo’larından ayırt edemezler. Bu sınırlamayı gidermek için, yakın zamanda kemik iliği SSC’lerinden (BM-SSC’ler)11’den P-SSC’leri belirgin bir şekilde görselleştirmek için çift muhabir fare (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) geliştirdik. Bu model ile P-SSC’lerin Mx1+αSMA+ çift etiketleme ile işaretlendiği, daha farklılaştırılmış Mx1+ hücrelerinin ise kemik iliği, endosteal ve periosteal yüzeyler ile kortikal ve trabeküler kemiklerde bulunduğu tespit edilmiştir11,12.
Çoklu sitokinler ve büyüme faktörlerinin kemik tadilatını ve onarımını düzenlediği bilinmektedir ve kritik segment kusurlarında iskelet onarımının arttırıcısı için test edilmiştir1,13. Bununla birlikte, kemik bölmesinin fiziksel bariyerinin bozulmasıyla ortaya çıkan yaralanma modellerinin hücresel karmaşıklığı nedeniyle, bu moleküllerin endojen P-SSC göçü ve iyileşme sırasında aktivasyon üzerindeki doğrudan etkileri belirsizdir. SSC’lerin fonksiyonel özellikleri ve göçmen dinamikleri genellikle diğer hücre popülasyonlarında göçü teşvik ettiği bilinen sitokinler veya büyüme faktörleri ile birlikte bir transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak değerlendirilir. Bu nedenle, bu in vitro deneylerden elde edilen sonuçların ilgili in vivo sistemlerinde uygulanması için yorumlanması zordur. Şu anda, iskelet sapı / progenitör hücre göçünün in vivo değerlendirmesi tipik olarak gerçek zamanlı olarak gözlenmez; aksine, kırık sonrası sabit zaman noktalarında ölçülür5,7,14,15,16.
Bu yöntemin bir sınırlaması, geçişin tek hücre düzeyinde değerlendirilmemesidir; bunun yerine, hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ölçülür. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanarak, Mx1/Tomato/αSMA-GFP farelerinde 24-48 saat yaralanma sonrası kemik hasarında P-SSC’lerin kalvaria dikiş nişinden kemik yaralanmasına belirgin göçünü gözlemledik.
CCL5/CCR5 yakın zamanda erken yaralanma yanıtı sırasında işe alım ve aktivasyon P-SSC’lerini etkileyen düzenleyici bir mekanizma olarak tanımlandı. İlginçtir ki, gerçek zamanlı olarak bir yaralanmaya yanıt olarak önemli bir P-SSC göçü tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, CCL5 ile bir yaralanmanın tedavisi, gerçek zamanlı olarak yakalanabilen sağlam, yönlü olarak farklı bir P-SSC göçü üretir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, CCL5 ile tedaviden sonra P-SSC’lerin in vivo geçişini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6’da osteojenik/kondrojenik SSC’ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC’lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P. BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği’ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan’a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.
Materials
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
Riferimenti
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
