使用双标记 （MADM） 的马赛克分析开发脑皮质的血统跟踪和克隆分析

老鼠协议由机构临床前核心设施（PCF）和奥地利IST内部道德委员会审查。所有育种和实验都是根据奥地利和欧盟动物法，根据奥地利联邦科学和研究部批准的许可证进行的。 1. MADM克隆分析实验鼠的育种 设置定时实验 MADM 交配 （>P56;CD-1）在下午晚些时候（下午5：00），并检查阴道塞的程序上午（上午8：00）。插头存在的早晨算作第 0.5 天。有关实验鼠标交配设置的概述，请参阅图 2。确保CreERT2活动和分析的 TM 感应时间点适合解决实验问题。注：有关更多信息，请参阅下面的图 3和代表性结果。 对于产后取样，建立育种，以产生寄养母亲并行。注：这些应在建立实验育种前1~2天启动。 2. MADM 小鼠的 TM 感应 在15 mL或50 mL锥形离心管中溶解，并在室温（RT）下将其放置在摇台上，4小时，确保TM完全溶解，从而准备20mg/mL TM工作溶液。将工作溶液在4°C下用铝箔覆盖，并在2周内使用。 为了诱导 MADM 重组事件，使用 1 mL 结核素注射器和 25 G 针头将 TM 内插 （IP） 注射到时间正点怀孕大坝中。根据皮质神经发生阶段，在E10+E15之间注射TM，剂量为1~2mg/怀孕大坝。对于早期时间点（即E10），使用最多1毫克/怀孕大坝（25毫克/千克）来预防妊娠期间的并发症。对于 E11-E15 之间的时间点，请使用 2 mg/怀孕大坝 （50 mg/kg）7。注：或者，TM可以用口腔胶着进行妊娠后期。 对于 MADM 克隆分析到产后时间点，通过剖腹产在 E18+E19 中恢复活胚胎，然后与养母一起饲养幼崽。注：根据怀孕女性的健康状况，可能没有必要进行剖腹产，但仍需要与养母一起饲养幼崽，因为原TM治疗的母亲可能有哺乳问题。 要通过剖腹产恢复活胚胎或取回胚胎时间点进行分析，请通过宫颈错位牺牲怀孕的大坝。 将动物放在一个苏皮位置，用70%乙醇对毛皮进行消毒。用手术钳和剪刀在子宫上方的下腹部皮肤上做一个小切口。通过肌肉和腹部肌肉壁进行第二个切口，以揭示腹腔。 用剪刀从周围组织分离出子宫。将完整的子宫转移到装满温水的手套上，以提高胚胎存活率，直到每个子宫分别从子宫内取出。 使用细尖的剪刀和手指小心地打开子宫壁释放胚胎。不要将脐带切得太近，以防止大量失血。如果要使用胚胎进行分析，请继续执行步骤3.9。如果要培育幼崽，请继续执行步骤2.8。 如果需要寄养，在将幼崽转移给养母之前，请清洁幼崽。清洁幼崽时，不时轻轻按压胸部以启动呼吸。放回装满温水的第二只手套上，以提高存活率。注：用纸巾轻轻取出剩余的安尼翁和/或胎盘，这一点很重要。 在将幼崽转移给养母之前，将养母从笼子里取出，取出原来的幼崽，然后更换实验幼崽。把养母还到笼子里注：有关提高培养接受率的其他建议，请参阅讨论。 如果需要基因分型，在 P6+P8 之间收集头趾或尾部活检。注意：仅在动物实验许可证批准此做法时执行此步骤。 3. 大脑中 MADM 克隆的组织准备 注：对于包括产后组织（+P4）的实验，请继续执行步骤3.1。对于胚胎时间点和早期产后 （P0+P3），继续执行步骤 3.9。 用氯胺酮/西拉辛/乙丙胺溶液（分别65毫克、13毫克和2毫克/千克体重）的IP注射麻醉实验 MADM 动物，并确认小鼠通过捏后爪无反应。注：男性和女性 MADM 小鼠（CD-1 背景）均用于分析。如果需要基因分型，此时收集耳部活检。 将麻醉动物放在灌注手术托盘上的上部位置，用70%乙醇对毛皮进行消毒。要开始手术，用剪刀和手术钳小心地切口穿过皮肤的外层，然后通过肌肉层进行第二个切口。抬起胸骨的尖端，在两侧切割结缔组织，格外小心，避免切割肝脏。胸腔是可见的。 剪膜片，抬起来露出心。小心修剪肋骨保持架并固定到手术托盘上，以暴露心脏。对于幼崽，完全拆下肋骨笼。 将带磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的针头插入左下心室（苍白组织）。使用小虹膜剪刀切口到右中庭的后端（深红色组织），使血液排出。 使用 PBS 进行灌注，然后立即在 PBS 中准备新鲜制作的冰冷 4% 半甲醛 （PFA）。对于幼崽 （P4+P10），使用注射器进行灌注。用 10 mL 的 PBS 填充一个注射器，用 10 mL 的 4% PFA 填充另一个注射器。确保已清除注射器中的所有气泡。对于年长的动物，使用近体泵。 开始使用 PBS（10 mL，2~4 mL/min 幼崽;20 mL，4~6 mL/min，成人使用近位泵）。如果针头定位正确，肝脏将变得清晰和淡黄色。 完成后，从幼崽中取出针头，并将含有PFA的针头插入同一孔中。对于成人，在将 PBS 溶液与冰冷的 PFA 交换之前，请停止近位泵，确保避免吸收管中出现气泡。使用PFA（10 mL，2~4 mL/min，幼崽30 mL，4~6 mL/min，成人使用近位泵）恢复使用。 灌注完成后，斩首鼠标，并通过仔细解剖切除大脑。将大脑转移到 4% PFA。使用至少5倍的脑容量（即15 mL锥形离心管中的±5±10 mL PFA），并在4°C孵育过夜，进行灌注后固定，以确保组织完全固定。继续执行步骤 3.10。 对于胚胎组织和早期产后组织（即P0+P3），在进行剖腹产后，用剪刀斩首胚胎。如果需要基因分型，此时收集胚胎的尾部。立即解剖大脑，转移到含有2~3 mL的4%PFA/井的12井板。在4°C孵育过夜，用于修复后。 第二天早晨，用10 mL（成人）或2~3 mL（胚胎）交换PFA，在RT.将组织转移到磷酸盐缓冲液（PB）中的30%蔗糖溶液，并在4°C的摇杆平台上储存，直到组织沉入溶液中。 将大脑嵌入到最佳切削温度（OCT）化合物中，注意为日冕或下垂分切调整大脑。将嵌入模具放在干冰上，直到 OCT 完全不透明（约 10~15 分钟），进行冷冻。将组织储存在-80°C，直到进一步使用。 4. 免疫组织M组准备 通过将 OCT 环应用于磁盘，并在开始冻结时将组织块直接放入 OCT 中，将组织块连接到低温恒温器中的试样盘上。确保块正确定向到所需的切割平面。注：这里，冠状剖面研究皮质 MADM 克隆是详细描述。 将低温恒温器中的块温度设置为 -20 °C，将叶片温度设置为 -21 °C。 通过将试样盘安装到试样支架上，让组织块调节到腔室温度，并在开始分节前在低温恒温器中保留约 5 分钟。 在厚段（45~60 μm）中修剪块，直到达到感兴趣的组织区域。 一旦皮层的边缘清晰可见，停止切割并锁定刀片。在修剪块之前，确保刀片已屏蔽。 用刀片修剪多余的 OCT，在大脑的四面留下 ±1~2 毫米的 OCT。 接下来定向块，使皮层的一个侧边向下，另一个向上（即，皮层最左边缘是指向右）。 成人克隆的厚度为45μm，胚胎克隆的厚度为30μm。分别执行每个部分，并使用小刷子在修剪块时保持刀下区域清洁任何留下的碎屑。注意：如果未完成此操作且节数下降，则可能难以确定切片的正确顺序。 如果截面开始卷曲，修剪块的边缘和/或仔细调整玻璃反辊板。 对于胚胎克隆分析，将截面直接安装到磨砂幻灯片上。在 37 °C 的加热板上干燥，然后直接进入步骤 5.6。注：可以向一张幻灯片添加多个部分，但可确保保持顺序顺序。 要收集成年克隆，请准备 24 个包含 1 mL PBS/孔的井板（通常每个大脑 5~6 个板）。从第一个井开始，用冷钳按剖面的顺序收集PBS中的单个串行节。注：成人组织采用浮动截面法，以确保没有遗漏任何截面，并且安装部分不包含皱纹。 到达新皮质结束后停止分段。 对于成年克隆，继续安装浮动部分。注：部分可保持在 PBS 中 4 °C，长达 24 小时。 5. 安装成人组织进行成像 注：需要以下工具：小喷漆刷、培养皿、带0.5%Tween（PBS-T）、粘附滑片（材料表）、安装介质（材料表）、盖玻片和钳子的PBS。 用 PBS-T 填充培养皿。注：洗涤剂用于帮助安装过程。如果需要染色对洗涤剂（即糖蛋白）敏感的其他抗原，最好跳过加入 Tween。 将粘附幻灯片放入 PBS-T 中，以便其几乎被覆盖到标签上。 将第一部分转移到 PBS-T 中。 使用小型油漆刷将截面操纵到幻灯片上并排列以保留切割顺序。以相同的方式继续执行所有其他部分。 一旦所有部分都到位，将幻灯片（±12×16 节/幻灯片）放在黑暗的幻灯片室中。稍微抬起盖子，使部分完全干燥（约 10~20 分钟），确保它们在随后的步骤中保持粘附。 如果对额外的抗原进行免疫组织化学，请直接转到第 6 节或第 7 节。注：对于胚胎时间点，必须至少对GP和tD执行免疫处理步骤（第6节）。对于成年克隆，只有在同时染色其他抗原时（第 6 节和第 7 节），才需要这样做。 用 1x PBS 重新补充和清洗 1x 节，5 分钟，以去除残留的 PBS-T。将 ±1 mL 的 4°、6-二-苯酚（DAPI）稀释在 1x PBS （1 μg/mL） 中，确保覆盖所有部分并孵育 15 分钟。 小心地取出DAPI，用1x PBS清洗1×5分钟。取出多余的PBS，干燥±1~2分钟，然后再嵌入110μL的安装介质中。用 24 x 60 mm 盖玻片密封，在成像前让干燥至少 3 小时。 6. 仅用于 GFP 和 td 的免疫 注：本节是胚胎克隆所必需的。 水平将幻灯片放在加湿的幻灯片孵化室中。使用蜡标记标记幻灯片边界，以最大限度地减少所需的缓冲区量。 带 1x PBS 的补液部分。为了提高染色质量，使用新鲜分段的组织。 每张幻灯片添加 250~400 μL 的阻塞缓冲液（0.5% Triton X-100，2~3% 正常驴血清在 1x PBS 中），确保所有部分都包括在内。孵育1小时。注：洗涤剂（Triton X-100 或 Tween-20）的浓度会因使用的其他原抗体而异，因为某些抗原对洗涤剂比其他抗原更敏感。 去除阻塞缓冲液，并在阻断缓冲液中向幻灯片（300±400 μL/幻灯片）添加原抗体。注：抗GFP/抗tDT（MADM）的标准原抗体反应示例可以使用鸡肉抗GFP（1：500）和兔子抗RFP（1：500）。 在4°C下用原抗体孵育过夜。注：幻灯片必须完全水平地孵育，缓冲器覆盖所有部分。否则，可能导致不平整或不良染色。 第二天早上确认，含有原抗体的阻塞缓冲液仍然覆盖幻灯片上的所有部分。如果没有，在RT下重复孵育步骤3~4小时。 去除原抗体，用1x PBS洗涤4x，在RT下洗涤10分钟。 加入在阻断缓冲液中稀释的二次抗体（300~400μL/幻灯片）：Alexa Fluor 488 抗鸡 IgG （1：500） 和 Cy3 抗兔 IgG （1：500）。 在 Rt 孵育 2 小时， 保持幻灯片从光线覆盖， 以防止氟磷漂白。 去除二次抗体，用1x PBS洗涤2×10分钟。 用在PBS中稀释的DAPI（1：5，000）孵育15分钟。 用 1x PBS 清洗 1x 部分 10 分钟。 在嵌入 110 μL 的安装介质中之前，取出多余的 PBS 并干燥 ±1~2 分钟。 用 24 x 60 mm 盖玻片密封，在成像前让干燥至少 3 小时。图像在进行免疫组织化学后 1~2 周内滑动，以确保最佳信号。 7. 用于 GFP、tdT 和其他抗原的免疫 执行步骤 6.1~6.3。 去除阻塞缓冲液，并在阻断缓冲液中向幻灯片（300±400 μL/幻灯片）添加原抗体。注：当染色三种或三种或更多抗原（即GP、tdT和感兴趣的蛋白质）和有关蛋白质的抗体在兔子中产生时，建议在1：500稀释时使用抗tDT（山羊）原抗体。三种抗原的原抗体反应与替代 tdT 染色的例子可以使用鸡抗 GFP （1：500），山羊抗 tdT （1：500）， 和抗体对感兴趣的蛋白质 （即兔子）. 执行步骤 6.5~6.7。 添加在阻断缓冲液中稀释的二次抗体混合物滑动（300~400μL/幻灯片）：亚历克萨氟488抗鸡IgG（1：500）、Cy3抗山羊IgG（1：500）和亚历克萨氟647抗兔IgG（1：500）。 执行步骤 6.9~6.14。 8. MADM 克隆的共生图像采集和定量 识别和记录包含克隆的大脑部分及其在皮层中的位置。注：克隆跨度的节数因克隆的诱导时间、CreERT2驱动程序和分析时间而异。此步骤可以在共合显微镜或荧光显微镜上执行。 使用倒置共体显微镜，首先选择和配置正确的激光线和滤镜。对于 MADM 大脑，选择 DAPI、GFP 和 tDT（激发：358 nm、488 nm 和 554 nm;峰值发射：461 nm、507 nm 和 581 nm）。确保针孔设置为 1 个通风单元，以实现最佳成像质量。 对于共和特定设置，图像克隆具有 20 倍的目标和 1 倍的缩放。对于将用于量化的图像，请使用扫描速度像素停留值 1.52±2.06 μs（图像采集软件中的值 7~8），不进行平均。根据需要调整每个通道的激光强度和增益设置。注：根据所需的图像质量，扫描速度和平均设置可能会有所不同。 明确识别克隆后，安排映像切片以覆盖克隆中的所有相关部分。调整 z 堆栈，以便以 1.5 μm/z 堆栈切片的间隔捕获克隆中所有 MADM 标记的单元格。调整平铺区域，以便成像克隆时捕获皮层的整个宽度（即，从皮亚尔表面到语料库）。 连续跨越多个截面的图像单个克隆，确保克隆内没有单元格的任何部分仍进行图像成像，以便进行 3D 重建和正确解释单元格空间信息。 分析每个部分包含 MADM 克隆的细胞，按顺序从 rostral 到皮层的孔面端。根据单个神经元和胶质的形态和/或标记染色来区分它们。根据核染色 （DAPI） 定义的各层边界并行记录位置信息。注：有关胚胎分析的代表性结果，请参见图4;参见图 5，了解成人分析的代表性结果。 9. 克隆的串行 3D 重建 注：通过串行大脑部分成像的单个克隆的 3D 重建对于可视化显示以及 3D 克隆体系结构的分析非常有用，并且可以按照以下步骤执行。 使用图像采集软件根据采集参数拼接和融合共体平铺图像。打开 .czi 文件，然后在 ZEN软件（Zeiss）中的”处理”选项卡下运行拼接方法。 以 TIFF 格式将拼接的图像堆栈导出为单独的 z 平面。打开已拼接的 .czi 文件，然后在”处理”选项卡下运行图像导出方法。对于多通道图像，请导出为红色/绿色/蓝色图像，以便进行后续图像处理。 对克隆的每个串行大脑部分重复步骤 9.1 和 9.2。注：为了精确的3D重建，克隆内的所有大脑部分，包括那些没有标记的细胞，也必须处理。 使用开源图像处理软件（如 ImageJ/Fiji67，68）将单个图像串联到单个堆栈中，从最圆体到最圆锥形的 z 平面开始。注：此时应删除每个大脑部分边缘的任何空白图像。 如果需要，请按照步骤 9.5.1=9.5.5，按照步骤 9.5.1=9.5.5 更正从步骤 9.4 获得的图像堆栈，以使用名为”MultiStackReg”的 ImageJ插件进行不对齐。如果不需要图像对齐，请继续执行步骤 9.6。注：此插件执行具有最高对比度（通常为 DAPI）的通道的图像对齐，然后将记录的变换应用于其他通道，从而允许多通道堆栈进行可靠的图像对齐。必须预安装名为”TurboReg”的辅助插件。 在 ImageJ 中，安装 [多堆栈Reg]和 [TurboReg]插件。 打开从步骤 9.4 获得的克隆图像的图像堆栈进行对齐。在”图像”选项卡下”颜色”选项中，将通道拆分为 DAPI（蓝色）、GFP（绿色）和tDT（红色）。 运行 “多堆栈Reg”插件，通过”刚体”转换对齐 DAPI通道并保存转换文件。 使用”多堆栈Reg”将保存的转换文件应用于其他两个通道。 合并所有三个对齐的通道并保存对齐的堆栈。 要将 ImageJ 中的克隆定向，请以垂直方向旋转从步骤 9.4（或对齐后的步骤 9.5.5）获得的克隆图像堆栈，其顶部为 pial 曲面，底部为语料库调用体。如有必要，在 xy 平面中裁剪。 对于定性表示和定量分析，生成克隆的最大 z 投影图像（步骤 9.8）或执行克隆的 3D 渲染（步骤 9.9）。 在 ImageJ 中，从步骤 9.6 打开图像堆栈，并选择具有投影类型”最大强度”的Z 投影选项。这将生成在同一平面上投影的整个克隆的图像。 在 ImageJ 中，从步骤 9.6 打开图像堆栈并选择3D Project z 函数以生成可旋转的克隆的 3D 可视化效果。注：在此步骤中，在图像采集期间输入与单个 z 堆栈厚度相等的正确切片间隔非常重要。应使用插值工具去除切片之间的间隙。