Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento
Summary
Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.
Abstract
As lipoproteínas de proteobactérias são modificadas pós-translacionalmente por ácidos graxos derivados de fosfolipídios de membrana pela ação de três enzimas integrais de membrana, resultando em proteínas triacilatadas. O primeiro passo na via de modificação da lipoproteína envolve a transferência de um grupo diacilglicerila do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína, resultando em prolipoproteína diacilglicerila. Na segunda etapa, o peptídeo de sinal da prolipoproteína é clivado formando uma apolipoproteína, que por sua vez é modificada por um terceiro ácido graxo derivado de um fosfolipídio. Esta última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt). A via de modificação da lipoproteína é essencial na maioria das γ-proteobactérias, tornando-se um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Descrito aqui é um ensaio sensível para Lnt que é compatível com triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibitórias. A enzima e os substratos são moléculas embutidas na membrana; por conseguinte, o desenvolvimento de um ensaio in vitro não é simples. Isso inclui a purificação da enzima ativa na presença de detergente, a disponibilidade de alquinofosfolipídios e substratos peptídicos diacilglicerilos e as condições de reação em micelas mistas. Além disso, para usar o teste de atividade em uma configuração de triagem de alto rendimento (HTS), a leitura direta do produto da reação é preferida às reações enzimáticas acopladas. Neste ensaio enzimático fluorométrico, o produto peptídico alquino-triacilado é tornado fluorescente através de uma reação de click-chemistry e detectado em um formato de placa multipoço. Este método é aplicável a outras aciltransferases que utilizam substratos contendo ácidos gordos, incluindo fosfolipídios e acil-CoA.
Introduction
As lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por ácidos graxos covalentemente ligados em seus amino-termini através dos quais são ancoradas em membranas 1,2. A parte madura da proteína é altamente diversificada em estrutura e função, explicando assim o papel das lipoproteínas em vários processos biológicos no envelope celular bacteriano.
As lipoproteínas são modificadas por ácidos graxos derivados de fosfolipídios após a inserção na membrana citoplasmática. As prolipoproteínas contêm um motivo de assinatura, a lipocaixa, que contém um resíduo de cisteína invariante que se torna acilado e o primeiro aminoácido na proteína madura. O primeiro passo desta via é catalisado pela prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacylglyceryl transferase (Lgt), que transfere o grupo diacilgliceril do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína através de uma ligação tioéter entre diacilgliceril e cisteína. A peptidase de sinal II (Lsp) cliva o peptídeo de sinal da prolipoproteína diacilglicerila, resultando em uma apolipoproteína que é ancorada na membrana através de sua porção diacilgliceril. A terceira e última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt), que adiciona um ácido graxo da posição sn-1 do fosfolipídeo à apolipoproteína, resultando em lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. A reação Lnt é uma reação de pingue-pongue de duas etapas onde um intermediário estável da enzima tioéster acila é formado. O subproduto lisofosfolipídio é liberado antes da acilação do substrato apolipoprotéico na segunda etapa da reação.
A especificidade do substrato fosfolipídico é determinada em um ensaio de Lnt com base no deslocamento de mobilidade do peptídeo N-acilo diacilglicerilo em uma alta porcentagem de ureia Tris-Tritrina SDS-PAGE4. Fosfolipídios com pequenos grupos polares, saturados [sn-1] e não saturados [sn-2], foram substratos preferenciais 4. O ensaio de deslocamento de gel não é apropriado para estudos cinéticos extensivos da apolipoproteína N-aciltransferase nem para a HTS identificar moléculas inibitórias. A química do clique usando ácidos graxos alquinos tem sido usada com sucesso para estudar a modificação de lipoproteínas em bactérias5 e o metabolismo de ácidos graxos em eucariotas6. Recentemente, um ensaio in vitro de palmitoilação de Ras foi relatado para identificar inibidores7.
No método descrito aqui, o Lnt ativo purificado em detergente é incubado com substratos em micelas mistas para formar peptídeo alquino-triacilado que é subsequentemente detectado por espectrometria de fluorescência.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo para o ensaio de Lnt aqui descrito, baseado na detecção de fluorescência do produto triacilado, é sensível e reprodutível. A ligação específica e eficiente da biotina à estreptavidina é um elemento-chave no ensaio. O substrato Alquino-PAPA deixado após a conclusão da reação Lnt também é marcado fluorescentemente com FAME, mas é eficientemente removido após a ligação às placas de estreptavidina por várias etapas de lavagem. Além disso, a adição de DMSO não afeta a atividade de Lnt e …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Fabrice Agou e Alix Boucharlat da Plataforma de Triagem Quimiogenômica e Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Pesquisa (C2RT) do Institut Pasteur Paris por sugestões úteis sobre o protocolo, a todos os membros da Unidade BGPB por apoio e discussões científicas e a Simon Legood pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho foi financiado pelas Iniciativas de Cuidados Globais do Instituto Carnot Doenças Infecciosas e do Instituto Carnot Micróbios e Saúde (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
Riferimenti
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