Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel unter Verwendung der Echtzeitüberwachung der elektrischen Impedanz infizierter Zellen beschrieben. Eine praktische Anwendung dieser Methode wird durch die Quantifizierung des Influenza-A-Virus-Zerfalls unter verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern, die Umweltbedingungen nachahmen, vorgestellt.
Abstract
Methoden zur Quantifizierung von Viruspartikeln stellen einen kritischen Aspekt vieler virologischer Studien dar. Obwohl es mehrere zuverlässige Techniken gibt, sind sie entweder zeitaufwendig oder nicht in der Lage, kleine Variationen zu erkennen. Hier wird ein Protokoll zur präzisen Quantifizierung des viralen Titers vorgestellt, indem elektrische Impedanzvariationen infizierter Zellen in Echtzeit analysiert werden. Die zelluläre Impedanz wird durch Goldmikroelektroden-Biosensoren gemessen, die sich unter den Zellen in Mikroplatten befinden, wobei die Größe von der Anzahl der Zellen sowie ihrer Größe und Form abhängt. Dieses Protokoll ermöglicht eine Echtzeitanalyse der Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Morphologie und Migration mit erhöhter Sensitivität. Ebenfalls enthalten ist ein Beispiel für eine praktische Anwendung durch Quantifizierung des Zerfalls des Influenza-A-Virus (IAV), das verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt ist, die die virale Infektiosität im Laufe der Zeit beeinflussen (d. H. Temperatur, Salzgehalt und pH-Wert). Für solche Anwendungen reduziert das Protokoll den Arbeitsaufwand und generiert gleichzeitig präzise Quantifizierungsdaten von infektiösen Viruspartikeln. Es ermöglicht den Vergleich von Inaktivierungsneigungen zwischen verschiedenen IAV, was ihre Fähigkeit widerspiegelt, in einer bestimmten Umgebung zu persistieren. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen, ist hochgradig reproduzierbar und kann auf jedes Virus angewendet werden, das zytopathische Effekte in Zellkultur hervorruft.
Introduction
Die Übertragung eines Virus beruht auf der Kombination mehrerer Faktoren. Für ein virus, das in der Umwelt sezerniert wird, hängt seine Übertragung auch von der Fähigkeit ab, unter Bedingungen außerhalb des Wirts zu bestehen. Die Untersuchung der Virusinaktivierung im Allgemeinen ist daher ein entscheidender Schritt, um die nationalen Gesundheitsbehörden und politischen Entscheidungsträger bei der Umsetzung von Kontroll- und Biosicherheitsmaßnahmen zu unterstützen.
Das Wissen über die Persistenz von Viren in natürlichen und Laborumgebungen hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Bei Influenza-A-Viren (IAV) setzen ihre Übertragungswege Viruspartikel einer Vielzahl von Umweltbedingungen aus. Insbesondere können sie über 1) fäkal-orale Wege durch Wasser (d.h. Vogelviren) oder 2) direkten oder indirekten Kontakt durch kontaminierte Fomiten sowie Aerosole und Atemtröpfchen (d.h. Geflügel- und Säugetierviren)1 übertragen werden. In jedem Fall werden IAV verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern (d.h. pH-Wert, Salzgehalt, Temperatur und Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt, die ihre Infektiosität mehr oder weniger schnell beeinflussen2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere bei zoonotischen und pandemischen Viren ist es von großer Bedeutung, das Potenzial von Umweltfaktoren zur Beeinflussung der Virusdynamik und die Risiken einer Exposition und artenübergreifenden Übertragung zu bewerten.
Bisher wurden traditionelle virologische Techniken (d.h. virale Titerbestimmung durch Plaque-Assays oder 50% Abschätzung der infektiösen Dosis in der Gewebekultur) verwendet, um die IAV-Infektiosität im Laufe der Zeit zu bewerten; aber diese Techniken sind zeitaufwendig und erfordern viele Vorräte10,11,12. Die Messung der Impedanz infizierter Zellen im Laufe der Zeit mit Mikroelektroden dient als nützliches Werkzeug, um das IAV-Überleben unter verschiedenen Umweltbedingungen sowie die Virusinaktivierung im Allgemeinen zu überwachen. Diese Methode liefert objektive Echtzeitdaten, die die subjektive Beobachtung zytopathischer Effekte beim Menschen ersetzen. Es kann verwendet werden, um die Virustitration zu bestimmen, wodurch traditionelle Messungen mit niedrigeren Konfidenzintervallen ersetzt und arbeitsintensive Endpunkt-Assays vermieden werden.
Es besteht eine lineare Korrelation zwischen Titrationsergebnissen, die durch Messung der Zellimpedanz und durch klassische Plaque-Assay- oder TCID50-Methoden erhalten werden. Daher können Daten, die mit der impedanzbasierten Titrationsmethode erhalten werden, leicht in TCID50– oder pfu-Werte transformiert werden, indem eine Standardkurve mit serieller Verdünnung des Virus erstellt wird13,14,15,16,17. Der Nachweis, die Quantifizierung und die Wirksamkeit neutralisierender Antikörper in Serumproben können ebenfalls mit diesem experimentellen Ansatz erreicht werden18,19. In jüngerer Zeit wurden impedanzbasierte zelluläre Assays verwendet, um antivirale Verbindungen gegen Equid-Alphaherpesviren zu screenen und zu bewerten20.
Diese Technologie wurde verwendet, um die Persistenz von IAVs in Salzwasser bei verschiedenen Temperaturen zu bewerten und Mutationen im Hämagglutinin von IAV zu identifizieren, die die IAV-Persistenz in der Umwelt erhöhen oder verringern21. Ein solches Screening würde umfangreiche Arbeiten erfordern, wenn traditionelle Titrationsmethoden verwendet würden. Diese Methodik kann jedoch für jedes Virus verwendet werden, das sich auf die Zellmorphologie, die Zellzahl und die Stärke der Zelloberfläche auswirkt. Es kann auch verwendet werden, um die Persistenz unter verschiedenen Umgebungsbedingungen (z. B. in der Luft, im Wasser oder auf Oberflächen) zu überwachen.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet als Beispiel das IAV-Überleben im Wasser. Menschliche Influenzaviren sind über einen längeren Zeitraum verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt. Salzhaltiges (35 g/L NaCl) Wasser bei 35 °C wurde auf der Grundlage früherer Ergebnisse als Umweltmodell gewählt9. Die Restinfektiosität exponierter Viren wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zellinfektion quantifiziert. MDCK-Zellen, der Referenzzelltyp für die IAV-Amplifikation, werden auf 16 mit Mikroelektrodensensoren beschichtete Well-Mikrotiterplatten gesät und 24 h später von exponierten Viren infiziert. Die Zellimpedanz wird alle 15 Minuten gemessen und als beliebige Einheit ausgedrückt, die als Zellindex (CI) bezeichnet wird. Zytopathische Wirkungen, die durch das Influenzavirus induziert werden und deren Entstehungsrate direkt von der Anzahl der infektiösen Viruspartikel abhängt, die der Zellkultur geimpft werden, führen zu einer CI-Abnahme, die anschließend als CIT50-Wert quantifiziert wird. Dieser Wert entspricht der Zeit, die erforderlich ist, um eine Reduktion von 50% gegenüber dem ursprünglichen CI (d. h. vor der Viruszugabe) zu messen. CIT50-Werte , die für mehrere Umweltexpositionszeiten berechnet wurden, erlauben die Ableitung der Inaktivierungssteigung eines Virus nach linearer Regression der CIT50-Werte .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA ist eine impedanzbasierte Technologie, die zunehmend zur Echtzeitüberwachung von Zelleigenschaften wie Zelladhärenz, Proliferation, Migration und Zytotoxizität eingesetzt wird. In dieser Studie wird die Fähigkeit dieser Technologie zur Beurteilung des IAV-Überlebens außerhalb des Wirts durch messung der Virusinaktivierungssteigung nachgewiesen. Anspruchsvolle Techniken wie TCID50 und Plaque-Assays werden durch eine objektive Echtzeitbewertung der Zelllebensfähigkeit ersetzt und spiegeln so die durc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
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